1、首先就是涂片：將培養(yǎng)14-16小時的枯草芽孢桿菌涂片（注意期間涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰1-2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

2.染色：（1）初染  加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。（2）媒染  滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。（3）脫色  將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約20-30秒鐘，立即用水沖洗酒精。（4）復(fù)染  用番紅液染1-2分鐘，水洗，吸干水分。（5）鏡檢  干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。

革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如果脫色過度，陽性菌可被誤染為陰性菌，而脫色不夠，陰性菌可被誤染為陽性菌。除此以外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。atcc菌種購買

一、實驗?zāi)康恼莆崭锾m氏染色技術(shù)

二、基本原理：染色的基本步驟是：結(jié)晶紫初染，碘液媒染，乙醇脫色，番紅復(fù)染。經(jīng)染色后，保留初染劑藍紫色的為革蘭陽性菌，染上復(fù)染劑顏色（紅色）的為陰性菌。革蘭氏陽性菌細胞壁的肽聚糖為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，壁厚，類脂含量低，乙醇脫色時細胞壁脫水、肽聚糖層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不宜被洗脫保留在細胞內(nèi)，復(fù)染后仍保留初染劑的藍紫色。陰性菌肽聚糖層較薄，類脂含量高，脫色時，類脂溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物較易被洗脫，復(fù)染后，染上復(fù)染劑的紅色。

三、器材：培養(yǎng)48h枯草芽孢桿菌菌落革蘭氏染色液

四、操作步驟：1.制片常規(guī)涂片、干燥、固定2.初染結(jié)晶紫1min，水洗。3.媒染碘液1min，水洗。4.脫色95%酒精流加至洗出液無紫色，立即水洗5.復(fù)染番紅復(fù)染約2min，水洗。6.鏡檢先低倍找到要觀察區(qū)域，再高倍找到合適的視野，后觀察7.油鏡的清洗及載玻片清洗。

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