UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝

UltraRIPA kit for Lipid Raft

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代RIPA緩沖液

 

與常規(guī)的非變性細(xì)胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對(duì)困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質(zhì)。從常規(guī)緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質(zhì)功能的情況下能實(shí)現(xiàn)高效地提取，有利于對(duì)脂筏等蛋白質(zhì)的功能分析。

※本產(chǎn)品僅限于研究用。不可用于臨床治療。

 

◆細(xì)胞膜的可溶化和脂筏（Lipid Raft）

裂解細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析的時(shí)候，經(jīng)常會(huì)使用RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）緩沖液和1% Triton X-100緩沖液等的相對(duì)溫和的細(xì)胞膜裂解緩沖液。這些緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)造和功能的影響小，適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉降和各種結(jié)合實(shí)驗(yàn)等蛋白質(zhì)的功能分析。另一方面，與具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的SDS緩沖液相比，增溶能力較弱，完全不能溶解以脂筏（Lipid Raft）為主的細(xì)胞膜組分。許多表面活性劑都不能溶解脂筏，故其又被稱(chēng)為Detergent Resistant Membrane (DRM）。DRM中所含蛋白質(zhì)的功能分析被認(rèn)為是十分困難的。

 

 

脂筏（Lipid Raft）是由膽固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI錨定蛋白（GPI anchor protein）和棕櫚?；╬almitoylation）蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜構(gòu)造，被認(rèn)為是整合各種功能蛋白的功能域。神經(jīng)細(xì)胞突觸和免疫細(xì)胞的免疫突觸是脂筏的代表性例子。

 

脂筏示意圖

 

◆特點(diǎn)

●操作簡(jiǎn)單，能快速提取脂筏蛋白●使用兩種類(lèi)型的緩沖液（A buffer，B buffer）進(jìn)行兩個(gè)階段的提取。先提取出胞漿蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白●Buffer提取的任何蛋白質(zhì)都不會(huì)失活●A buffer和一般的RIPA buffer成分相同＊。B buffer含有表面活性劑，可以通過(guò)透析除去●適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞/組織●

使用本品配制的溶解液適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA法）、SDS-PAGE和Western blot等

＊

1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium

 Deoxycholate

 

◆緩沖液套裝組成

● A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

● B buffer（10 mL）

 

 

◆使用方法

1、用A buffer溶解組織或培養(yǎng)細(xì)胞?！鶠榱颂岣呷芙庑?，推薦使用均質(zhì)或超聲波破碎設(shè)備。2、

進(jìn)行離心分離，使A buffer中可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀）分離，分別回收。上層清液A

 buffer可溶性組分中主要含有胞漿蛋白和非脂筏蛋白。

3、往沉淀的A buffer 不溶性組分中加入B buffer，形成懸濁液。4、進(jìn)行離心分離，與步驟2一樣分離出可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀），分別回收。上層清液的B buffer可溶性組分中含有脂筏蛋白。5、可應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)。※A buffer和B buffer不可用于Bradford法蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)定量請(qǐng)使用BCA檢測(cè)?！褂帽酒稟 buffer和B buffer進(jìn)行兩個(gè)階段的提取是最適宜的，也有只對(duì)細(xì)胞使用B buffer進(jìn)行溶解和提取的例子。具體請(qǐng)參照以下例子。

 

 

UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比較

 蛋白分離蛋白結(jié)構(gòu)蛋白功能應(yīng)用胞質(zhì)蛋白膜蛋白非脂筏蛋白脂筏蛋白＞1%SDS buffer○○○╳╳SDS-PAGERIPA buffer○○╳○○

酶分析法測(cè)定

免疫沉淀

SDS-PAGE等

UltraRIPA○○○○○

 

◆應(yīng)用例

從脂筏中提取總蛋白

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer進(jìn)行提取。提取后的總蛋白用SDS-PAGE/銀染色檢測(cè)（左），用BCA法定量蛋白質(zhì)（右）。相對(duì)于具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的2% SDS緩沖液，UltraRIPA kit能夠提取70%以上的蛋白質(zhì)。

※不能保證全部蛋白質(zhì)的可溶性都得到改善。

 

脂筏標(biāo)記蛋白的提取

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer，提取后進(jìn)行SDS-PAGE。利用對(duì)應(yīng)脂筏標(biāo)記蛋白的抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

 

 

脂筏標(biāo)記蛋白的免疫沉淀

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分，通過(guò)B buffer提取脂筏標(biāo)記蛋白。對(duì) buffer提取物使用脂筏標(biāo)記蛋白PSD95的抗體和G蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫沉淀。使用銀染色和抗PSD95抗體通過(guò)Western blot檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。

 

 

提取的蛋白質(zhì)的酶活性測(cè)定

用1%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS溶解CHO細(xì)胞，測(cè)定溶解物中乳酸脫氫酶（LDH）的活性。2%SDS具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用，在幾乎完全失活的情況下，1% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和UltraRIPA kit B buffer所得的酶活性大致相同。

 

 

從脂筏中提取功能蛋白

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分。用A buffer分三次沖洗不溶性組分，消除RIPA可溶性組分中脫磷酸酶的活性。往不溶性組分中分別添加2% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和B buffer，測(cè)定各種提取物的總脫磷酸化酶活性。下圖是各緩沖液從RIPA不溶性組分中提取的蛋白質(zhì)的量（左軸：黑）和所檢測(cè)的脫磷酸酶的活性（右軸：紅）的示意圖。2% SDS buffer能夠從RIPA不溶性組分中很好地提取蛋白質(zhì)，但容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，完全失去脫磷酸化活性。RIPA buffer不能提取蛋白質(zhì)，活性也無(wú)法檢測(cè)。UltraRIPA kit B buffer所提取的蛋白質(zhì)大約為2% SDS buffer的70%，且可以檢測(cè)出較強(qiáng)的脫磷酸化活性。

 

UltraRIPA kit B buffer單獨(dú)提取脂筏蛋白的可能性評(píng)價(jià)

※數(shù)據(jù)提供：東京大學(xué)藥學(xué)院研究生院保健化學(xué)系

 

用PBS沖洗COS-1細(xì)胞，分別使用SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和UltraRIPA kit B buffer裂解，通過(guò)離心分離（14,000 rpm, 5 min,4℃）可溶性組分和不可溶性組分。不可溶性組分用等量的SDS-PAGE樣品緩沖液變性溶解。脂筏標(biāo)記Flotilin1的可溶部分通過(guò)SDS-PAGE/western blot測(cè)定。使用1% Triton X-100和RIPA buffer，大部分的Flotilin 1不溶性膜組分沒(méi)有被溶解，而UltraRIPA kit B buffer幾乎可以全部溶解。

 

 

◆各buffer組成

●SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）●

UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，

0.5％ Sodium Deoxycholate)

●UltraRIPA kit B buffer (成分保密)●1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）

 

◆Q A

Q-1．如果單獨(dú)使用B緩沖液，溶解效率是否高于RIPA緩沖液？

A-1．B緩沖液的溶解活性比RIPA（A緩沖液）高。本試劑盒的操作分為2個(gè)階段，首先將RIPA不溶性組分回收并用B緩沖液將其溶解，并以濃縮和簡(jiǎn)單提取RIPA不溶性組分中含有的脂筏蛋白為目的而進(jìn)行第2階段的操作。但是，如果是直接用B緩沖液處理樣本的時(shí)候，溶解率的確比RIPA高。

 

Q-2．使用ULTRARIPA Kit是否只可以提取脂筏蛋白？

A-2．多數(shù)研究認(rèn)為，脂筏的細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷和神經(jīng)突觸中含有的組成蛋白不能用Triton X-100等溫和的表面活性劑溶解，因此認(rèn)為表面活性劑的不溶性組分（DRM）是生化脂質(zhì)筏。本產(chǎn)品著眼于RIPA不溶性組分富含的脂筏蛋白，用B緩沖液進(jìn)一步使其溶解，使得脂筏蛋白在非變性狀態(tài)下溶解。因此，即使不是脂筏，只要是不溶于RIPA的樣本，都可以使用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（關(guān)于核蛋白的污染參見(jiàn)Q-3）。本試劑盒使用溶解能力較高的RIPA緩沖液作為A緩沖液，但是也可以用1% Triton X-100等的裂解緩沖液代替RIPA緩沖液。

 

Q-3．推薦使用均質(zhì)或超聲破碎設(shè)備，單獨(dú)使用渦旋和移液是否不夠充分？

A-3．本產(chǎn)品采用A緩沖液溶解后離心，并回收RIPA不溶性組分這樣簡(jiǎn)單的步驟。因此，如果有細(xì)胞/組織的未破碎物或核殘留的話，則可能污染RIPA不溶性組分。特別是RIPA緩沖液的核溶解效率較弱，如果不添加物理破碎，則核可能會(huì)大量殘留在RIPA不溶性組分中。另一方面，由于B緩沖液的核溶解率較高，如果有核殘留的話就會(huì)釋放出DNA，使溶液變渾濁。在A緩沖液溶解時(shí)進(jìn)行超聲處理的話可以破壞核以及使基因組DNA片段化。核的污染可能會(huì)影響后續(xù)的應(yīng)用，因此，我們強(qiáng)烈推薦使用均質(zhì)或超聲破碎設(shè)備。

 

Q-4．B緩沖液的成分是什么種類(lèi)的表面活性劑。聽(tīng)說(shuō)表面活性劑的種類(lèi)會(huì)影響電泳，我想知道它的成分。

A-4．非常抱歉，B緩沖液的成分是非公開(kāi)的。 我們無(wú)法告訴您表面活性劑的種類(lèi)。然而，我們可以確定B緩沖液不會(huì)影響電泳。

 

Q-5．幾乎無(wú)法看見(jiàn)A不溶性組分。即使添加了B緩沖液也無(wú)法獲取蛋白質(zhì)量，怎么辦？

A-5．RIPA緩沖液可以溶解90~95%包括膜蛋白在內(nèi)的總蛋白（根據(jù)組織/細(xì)胞種的不同多少會(huì)有點(diǎn)差別）。因此，考慮蛋白質(zhì)總量時(shí)，RIPA不溶性組分中含有的蛋白為樣本總體的10%以下。肉眼無(wú)法看見(jiàn)RIPQ不溶性組分時(shí)，需要增加細(xì)胞數(shù)/組織量。想要提高B緩沖液溶解組分蛋白濃度時(shí)，減少添加至RIPA不溶性組分的B緩沖液的量就可以得到改善。我們建議您可以設(shè)置如下的陽(yáng)性對(duì)照。

 

探討樣本量的陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)

需要準(zhǔn)備的試劑：2% SDS緩沖液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,150 mM NaCl，2% SDS）

步驟：回收RIPA不溶性組分后，添加2%SDS緩沖液，通過(guò)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)，可以預(yù)估RIPA不溶性組分中含有的蛋白質(zhì)總量。

 

Q-6．在A緩沖液溶解組分中可以觀察到脂筏標(biāo)記物，有什么改善的方法嗎。

A-6．我們無(wú)法保證在其他方法中作為脂筏標(biāo)記物被檢測(cè)出的蛋白能否在A緩沖液不溶性組分中獲得。特別是根據(jù)脂筏標(biāo)記物的不同，細(xì)胞種類(lèi)/組織，有無(wú)外部信號(hào)也會(huì)有變動(dòng)。我們會(huì)根據(jù)以下案例提供相關(guān)的改善方法，請(qǐng)酌情參考。

 

例1：不溶于1％Triton X-100，但用RIPA緩沖液可以檢測(cè)出可溶性組分。

改善方法：可能是由于RIPA緩沖液（1%NP-40，0.1% SDS,0.5% sodium deoxycholate）的提取效率比1％Triton X-100強(qiáng)，所以能將其溶解。這時(shí)候，可以通過(guò)用1％Triton X-100緩沖液代替A緩沖液來(lái)濃縮以及溶解目的蛋白。

例2：離心條件不足時(shí)，雖然不溶解，但是不沉淀。

改善方法：雖然我們推薦的離心條件為10,000 g，但是根據(jù)目的蛋白的不同，離心10,000 g可能不足。這時(shí)，也有把離心條件調(diào)整為20,000 g之后得到改善的案例。因此，我們建議您可以探討一下離心條件。

 

Q-7．用B緩沖液洗脫的蛋白可以用于質(zhì)譜分析嗎？

A-7．B緩沖液溶解的蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離后，可以通過(guò)一般的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的順序（切割凝膠，在凝膠中進(jìn)行胰蛋白酶消化，提取肽以及脫鹽操作）進(jìn)行分析。

 

Q-8：用B緩沖液提取后，我想用適合試驗(yàn)的緩沖液來(lái)置換它。 可以通過(guò)透析去除B緩沖液的表面活性劑嗎？

A-8：B緩沖液含有的表面活性劑可以通過(guò)透析去除。請(qǐng)使用孔徑為5 kDa的透析膜。但是，也有根據(jù)蛋白質(zhì)的不同，在去除表面活性劑時(shí)也可能會(huì)聚集或變性，需要添加別的表面活性劑到透析緩沖液中。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。