您所在位置：上海翊圣生物科技有限公司 分子生物學(xué)  12302ESHieff NGSTM DNA Quantification Kit for Illumina
本產(chǎn)品是用于lllumina 平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)濃度定量的專(zhuān)用試劑盒，提供定量所需的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、qPCR Master Mix、定量擴(kuò)增引物和參比染料ROX。其中，DNA標(biāo)準(zhǔn)品包含經(jīng)梯度稀釋的六份450 bp的雙鏈DNA溶液，濃度為20 pM-0.0002 pM；擴(kuò)增引物對(duì)根據(jù)NGS文庫(kù)接頭序列P5和P7設(shè)計(jì)，可保證特異性擴(kuò)增雙端接頭完整的文庫(kù)分子。 【詳細(xì)說(shuō)明】

Hieff NGSTM DNA Library Quantification Kit for Illumina

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

儲(chǔ)存

價(jià)格（元）

Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina , qPCR Master Mix

12302ES05

500 T

-20℃

1526.00

Hieff NGSTM Library Quantification Kit for Illumina , DNA Standard 1-6

12307ES09

6 96 L

-20℃

2126.00

產(chǎn)品描述

本產(chǎn)品是用于lllumina 平臺(tái)高通量測(cè)序文庫(kù)濃度定量的專(zhuān)用試劑盒，提供定量所需的DNA標(biāo)準(zhǔn)品、qPCR Master Mix、定量擴(kuò)增引物和參比染料ROX。其中，DNA標(biāo)準(zhǔn)品包含經(jīng)梯度稀釋的六份450 bp的雙鏈DNA溶液，濃度為20 pM-0.0002 pM；擴(kuò)增引物對(duì)根據(jù)NGS文庫(kù)接頭序列P5和P7設(shè)計(jì)，可保證特異性擴(kuò)增雙端接頭完整的文庫(kù)分子；qPCR Master Mix是基于抗體法熱啟動(dòng)的染料法qPCR預(yù)混液，可在不同長(zhǎng)度、不同GC或AT含量樣本中高效、特異擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)精確定量。

本試劑盒已經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量和功能檢測(cè)，試劑盒所有組分均達(dá)到DNA污染控制的嚴(yán)格質(zhì)控要求，應(yīng)用于NGS文庫(kù)定量精確靈敏，且批間穩(wěn)定，結(jié)果重現(xiàn)性優(yōu)異。

產(chǎn)品組分

組分名稱

規(guī)格

12302ES05

12307ES09

Hieff NGSTM SYBR qPCR Master Mix (2 )

5 1 mL

--

qPCR Primer Mix

600 L

--

Rox (25 M)

200 L

--

Rox (250 M)

200 L

--

DNA Standards 1-6

6 96 L

--

注意：

1. 根據(jù)儀器類(lèi)型選擇合適的參比染料ROX。

類(lèi)別

機(jī)型

不添加ROX

Bio-Rad CFX96 , CFX384 , iCycler iQ , iQ 5, MyiQ , MiniOpticon , Opticon , Opticon 2, Chromo4 Cepheid SmartCycler ; Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Illumina Eco qPCR; Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000; Roche Applied Science LightCyclerTM480; Thermo Scientific PikoReal Cycler.

添加Rox (250 M)

Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast; StepOne , SteponePlus .

添加Rox (25 M)

Applied Biosystems 7500, 7500 Fast, ViiA 7; Stratagene MX4000 , MX3005P , MX3000P

2. qPCR Primer Mix 中包含一對(duì)引物，序列如下，可預(yù)先通過(guò)引物序列確認(rèn)文庫(kù)是否可以被該引物對(duì)擴(kuò)增。

Primer 1：5 -AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3

Primer 2：5 -CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。所有組分應(yīng)-20℃保存，qPCR Master Mix與ROX避光保存，效期6個(gè)月；如短期內(nèi)反復(fù)使用，qPCR Master Mix可解凍后于4℃避光暫存，效期3個(gè)月。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前確保產(chǎn)品凍融和徹底混勻，短暫離心收集至管底后置于冰上備用。

3. 為保證產(chǎn)品品質(zhì)，避免反復(fù)凍融超過(guò)30次！

4. 為避免樣品交叉和氣溶膠污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 試劑吸取時(shí)應(yīng)保證槍頭適當(dāng)深入液體，排出時(shí)應(yīng)確認(rèn)槍頭無(wú)殘留。

二、關(guān)于文庫(kù)稀釋

文庫(kù)需稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線有效Ct范圍內(nèi)進(jìn)行定量，稀釋比例可參照過(guò)往經(jīng)驗(yàn)或使用其他測(cè)定方式測(cè)定的濃度作為參考（如NanoDrop ，Qubit 或Bioanalyzer）。使用本試劑盒可定量的文庫(kù)濃度范圍參見(jiàn)下表。

由于DNA在非緩沖環(huán)境中易降解，因此應(yīng)使用緩沖稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）稀釋文庫(kù)，切勿使用水作為稀釋液。測(cè)定時(shí)，文庫(kù)應(yīng)現(xiàn)測(cè)定現(xiàn)稀釋?zhuān)糜诒洗郎y(cè)，切勿使用以往配制的儲(chǔ)存的稀釋后文庫(kù)。

表1  DNA Standard濃度

DNA Standard

摩爾濃度

質(zhì)量濃度

拷貝數(shù)濃度

Std 1

20 pM

5.5 pg/ L

12 106 copies/ L

Std 2

2 pM

0.55 pg/ L

12 105 copies/ L

Std 3

0.2 pM

0.055 pg/ L

12 104 copies/ L

Std 4

0.02 pM

0.0055 pg/ L

12 103 copies/ L

Std 5

0.002 pM

0.00055 pg/ L

12 102 copies/ L

Std 6

0.0002 pM

0.000055 pg/ L

12 101 copies/ L

三、污染與陰性對(duì)照（Contamination and No-template Controls）

1. 進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)保證良好的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，以防對(duì)工作區(qū)域、試劑、耗材、儀器、DNA標(biāo)準(zhǔn)品等造成污染。推薦將反應(yīng)體系配制區(qū)和模板制備區(qū)進(jìn)行物理隔離，并定時(shí)使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行擦拭清理。

2. 反應(yīng)體系配制過(guò)程中DNA Standards的加入應(yīng)按照從低濃度至高濃度（DNA Standard 6至1）的順序進(jìn)行，每次移液都應(yīng)更換新的槍頭，以避免氣溶膠污染。

3. 每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)平行進(jìn)行NTC陰性對(duì)照反應(yīng)，配合融解曲線進(jìn)行擴(kuò)增特異性和體系污染程度分析。因擴(kuò)增引物序列為Illumina 平臺(tái)固定序列而非qPCR專(zhuān)用引物序列，且擴(kuò)增循環(huán)數(shù)較多，NTC陰性對(duì)照反應(yīng)出現(xiàn)引物二聚體擴(kuò)增進(jìn)而產(chǎn)生Ct屬正常情況。正常情況下Ct (NTC) Ct (DNA Standard 6) + 3。

四. 擴(kuò)增曲線基線設(shè)置

因DNA Standard 1的摩爾濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)qPCR模板，其Ct往往非常小。而大部分qPCR儀器都默認(rèn)將3-15循環(huán)設(shè)置為基線（baseline），有時(shí)會(huì)將DNA Standard 1的Ct值誤認(rèn)為是測(cè)定時(shí)的噪聲背景，繼而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。手動(dòng)設(shè)置基線（baseline）為1-3循環(huán)可以有效避免這種情況發(fā)生。

五、文庫(kù)長(zhǎng)度矯正

為避免片段長(zhǎng)度對(duì)文庫(kù)定量的影響，需要在定量結(jié)果計(jì)算時(shí)，對(duì)文庫(kù)長(zhǎng)度進(jìn)行矯正。根據(jù)文庫(kù)熒光染料SYBR  Green I結(jié)合DNA后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與DNA分子量成正比的原則，根據(jù)以下公式進(jìn)行文庫(kù)濃度長(zhǎng)度矯正。

矯正后的稀釋文庫(kù)濃度（pM）= [450 bp /文庫(kù)平均長(zhǎng)度（bp）]  稀釋文庫(kù)的濃度（pM）

六、融解曲線分析

融解曲線在配合NTC陰性對(duì)照進(jìn)行污染程度分析以及確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線zui大有效Ct時(shí)至關(guān)重要，推薦每次實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行融解曲線采集步驟。本產(chǎn)品，DNA Standards產(chǎn)生的熔解曲線呈現(xiàn)特征單峰。

 

圖1 文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線

使用方法

一、解凍試劑

將Hieff NGSTM qPCR Mix，Primer Mix，DNA Standards 1-6，文庫(kù)稀釋液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.05% Tween 20），ROX Dye（如需要）從冰箱中拿出，冰浴解凍。各試劑解凍后，渦旋混勻，短暫離心后置于冰上備用。

二、稀釋文庫(kù)

使用文庫(kù)稀釋液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 [25℃] + 0.05% Tween 20）對(duì)待測(cè)文庫(kù)進(jìn)行適當(dāng)稀釋。推薦稀釋度為1:1000-1:100000。對(duì)于高濃度文庫(kù)，可額外設(shè)置3個(gè)2倍稀釋梯度，如按1:1000稀釋文庫(kù)，可額外設(shè)置1:2000，1:4000，1:8000稀釋比例，以保證測(cè)定值在試劑盒所提供的標(biāo)曲范圍內(nèi)。

三、反應(yīng)體系配制

于反應(yīng)管中配制如下體系，上下顛倒或渦旋振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

表2 qPCR反應(yīng)體系

名稱

體積

Hieff NGSTM SYBR qPCR Master Mix（2 ）

10  L

qPCR Primer Mix

1  L

Diluted DNA Library/DNA Standard 1-6/ddH2O*

2  L

ddH2O

7  L

Total

20 L

注：1）每個(gè)反應(yīng)至少設(shè)置3個(gè)平行；2）推薦進(jìn)行20 L反應(yīng)體系，如需進(jìn)行10 L反應(yīng)，則將體系各組分等比減少；3）*在陰性對(duì)照反應(yīng)管中加入ddH2O；在樣品反應(yīng)管中加入稀釋后的文庫(kù)；在標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)管中加入DNA Standards；4）根據(jù)機(jī)型添加合適ROX，推薦加入量0.5 L。

四、qPCR運(yùn)行程序

將反應(yīng)管置于qPCR儀中，按下述條件設(shè)置qPCR反應(yīng)程序，并運(yùn)行（熔解曲線可根據(jù)儀器默認(rèn)即可）。

表3 qPCR程序

步驟

溫度

時(shí)間

循環(huán)數(shù)

預(yù)變性

95℃

5 min

1 cycle

循環(huán)反應(yīng)

95℃

10 sec

40 cycles

60℃

45 sec*

熔解曲線

95℃

15 sec

1 cycle

60℃

60 sec

95℃

15 sec

注：*當(dāng)文庫(kù)平均長(zhǎng)度 700 bp時(shí)，建議延伸時(shí)間延長(zhǎng)至90 sec。

五、數(shù)據(jù)分析

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1）根據(jù)復(fù)孔間Ct差異 0.2的原則，對(duì)DNA Standards原始Ct進(jìn)行過(guò)濾，并計(jì)算平均Ct。

2）使用有效范圍內(nèi)的Ct（作為縱坐標(biāo)）和Log[pM]（作為橫坐標(biāo)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照NTC陰性對(duì)照Ct確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct有效范圍。

如Ct (NTC) Ct (DNA Standard 6) + 3，則zui大有效Ct為Ct (DNA Standard 6)，應(yīng)使用DNA Standard 1-6所產(chǎn)生的Ct繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

如Ct (DNA Standard 6) + 3 Ct (NTC) Ct (DNA Standard 5) + 3，則zui大有效Ct為Ct (DNA Standard 5)，應(yīng)使用DNA Standard 1-5所產(chǎn)生的Ct繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

如Ct (DNA Standard 5) + 3 Ct (NTC) Ct (DNA Standard 4) + 3，則zui大有效Ct為Ct (DNA Standard 4)，應(yīng)使用DNA Standard 1-4所產(chǎn)生的Ct繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

基于定量準(zhǔn)確性考慮，請(qǐng)至少使用4個(gè)Ct (DNA Standards)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如Ct (DNA Standard 4) + 3 Ct (NTC)，提示定量體系存在嚴(yán)重污染，需更換體系中所有組分后重復(fù)試驗(yàn)。

3）繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)不低于0.99，斜率應(yīng)位于-3.1至-3.6之間（表示擴(kuò)增效率位于90%-110%之間）。如標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)不佳，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。

2. 文庫(kù)濃度計(jì)算

稀釋文庫(kù)的Ct只有位于標(biāo)準(zhǔn)曲線有效Ct范圍之內(nèi)才可用于濃度計(jì)算，同時(shí)應(yīng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行長(zhǎng)度矯正?？筛鶕?jù)下述公式計(jì)算原始文庫(kù)濃度（nM）：

原始文庫(kù)濃度（nM）= [450 bp /文庫(kù)平均長(zhǎng)度（bp）] 稀釋文庫(kù)的濃度（pM） 稀釋倍數(shù)/1000

六、使用案例

用Hieff NGSTM DNA Library Quantification Kit for Illumina 定量嗜鹽桿菌基因組DNA文庫(kù)，文庫(kù)GC含量為70%，長(zhǎng)度450 bp。將文庫(kù)稀釋10000倍上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如下圖所示。根據(jù)標(biāo)曲及公式，文庫(kù)終濃度=4.37 pM  稀釋倍數(shù)10000=43.7 nM。

 

圖2  文庫(kù)qPCR精確定量

常見(jiàn)問(wèn)題

問(wèn)題

可能原因與解決方法

擴(kuò)增效率不在90%-110%

1. 如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) 3.1，且計(jì)算擴(kuò)增效率超過(guò)100%，提示反應(yīng)體系有污染。應(yīng)根據(jù)NTC陰性對(duì)照的融解曲線確認(rèn)污染源（文庫(kù)污染或DNA Standards污染）。

2. 不恰當(dāng)?shù)幕€基線（baseline）設(shè)置。手動(dòng)調(diào)整基線（baseline）為1-3循環(huán)。

3. 移液精確度差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保所有試劑使用前完全溶解并混勻。

相關(guān)系數(shù)R2  0.99

1. 移液精確度差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保所有試劑使用前完全溶解并混勻。

2. 儀器相關(guān)問(wèn)題，確保儀器與ROX匹配使用。

標(biāo)曲擴(kuò)增曲線分布不均一

1. Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) 3.1，提示反應(yīng)體系有污染。根據(jù)NTC

陰性對(duì)照的融解曲線確認(rèn)污染源（文庫(kù)污染或DNA Standards污染）。

2. Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) 3.1，提示基線基線（baseline）設(shè)置不當(dāng)。手動(dòng)調(diào)整基線基線（baseline）為1-3。

3. DNA Standards之間的 Ct 3.6，提示擴(kuò)增效率差。確認(rèn)所有試劑在使用前都已充分解凍并徹底混勻；確認(rèn)所有組分濃度正確以及反應(yīng)程序無(wú)誤。

4. 長(zhǎng)時(shí)間強(qiáng)光照射會(huì)導(dǎo)致qPCR Master Mix熒光值下降，進(jìn)而造成 Ct 3.6。應(yīng)按照推薦方式避光貯存試劑。

復(fù)孔重復(fù)性差

1. 移液精確度差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保所有試劑使用前完全溶解并混勻。

2. 儀器相關(guān)問(wèn)題，確保儀器與ROX匹配使用。

文庫(kù)稀釋液 Ct不在合理范圍（如2倍稀釋文庫(kù)， Ct為0.9-1.1）

1. 移液精確度差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保所有試劑使用前完全溶解并混勻。

2. 文庫(kù)難于擴(kuò)增。GC/AT含量過(guò)高或長(zhǎng)度超過(guò)1 kb的文庫(kù)擴(kuò)增效率較差。

3. 文庫(kù)降解。文庫(kù)應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)♂尯玫奈膸?kù)應(yīng)置于冰上備用。

文庫(kù)各稀釋度計(jì)算的初始文庫(kù)濃度差異超過(guò)10%

1. 移液精確度差，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確保所有試劑使用前完全溶解并混勻。

2. 文庫(kù)難于擴(kuò)增。GC/AT含量過(guò)高或長(zhǎng)度超過(guò)1 kb的文庫(kù)擴(kuò)增效率較差。

3. 文庫(kù)降解。文庫(kù)應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)♂尯玫奈膸?kù)應(yīng)置于冰上備用。

稀釋文庫(kù)Ct值不在標(biāo)曲Ct的有效范圍

1. 使用有效范圍內(nèi)的Ct值計(jì)算文庫(kù)濃度。當(dāng)Ct (稀釋文庫(kù)) Ct (DNA Standard 1)，提示文庫(kù)稀釋度不夠，應(yīng)提高文庫(kù)稀釋倍數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2. Ct (稀釋文庫(kù)) Ct (DNA Standard 6)，提示文庫(kù)稀釋度過(guò)高，應(yīng)減少稀釋倍數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3. 推薦稀釋度為1:1000-1:100000。對(duì)于高濃度文庫(kù)，可額外設(shè)置3個(gè)2倍稀釋梯度，如按1:1000稀釋文庫(kù)，可額外設(shè)置1:2000，1:4000，1:8000稀釋比例，以保證測(cè)定值在試劑盒所提供的標(biāo)曲范圍內(nèi)。

DNA Standard 1擴(kuò)增曲線異常

不恰當(dāng)?shù)幕€基線（baseline）設(shè)置。手動(dòng)調(diào)整基線（baseline）為1-3循環(huán)。

DNA Standards有擴(kuò)增，而文庫(kù)沒(méi)有或Ct很大

1. 文庫(kù)接頭序列錯(cuò)誤。核對(duì)文庫(kù)末端序列與試劑盒提供的引物序列是否匹配。

2. 稀釋度過(guò)高。減少稀釋倍數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3. 文庫(kù)降解。文庫(kù)應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋。

相關(guān)產(chǎn)品

建庫(kù)試劑盒

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

價(jià)格（元）

Hieff NGSTM MaxUP II DNA Library Prep Kit for Illumina

12200ES08

8 libraries

2456.00

12200ES24

24 libraries

6486.00

12200ES96

96 libraries

23567.00

Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina

12301ES08

8 libraries

2826.00

12301ES24

24 libraries

9756.00

12301ES96

96 libraries

32856.00

文庫(kù)定量

產(chǎn)品編號(hào)

規(guī)格

價(jià)格（元）

dsDNA HS Assay Kit for Qubit  

12640ES76

500 T

686.00

12640ES80

2000 T

2696.00

 

版本號(hào)：HB180530