活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例

 活體光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）技術(shù)與熒光（fluorescence）技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，今天，生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記到任何一種基因上，使對(duì)基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實(shí)。而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測(cè)信號(hào)。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。
 該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或基因的示蹤及檢測(cè)；基因治療在活體動(dòng)物體內(nèi)直接的觀察和檢測(cè)；基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動(dòng)物內(nèi)的研究；藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測(cè)；食品菌落生長(zhǎng)成像；皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像；法醫(yī)鑒定；微孔板成像，例如：免疫分析、報(bào)告基因、基因探針和嗜菌作用分析等；熒光團(tuán)的體內(nèi)成像，例如：Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的 -淀粉沉淀物分析；轉(zhuǎn)基因植物中通過(guò)報(bào)告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究；凝膠成像分析等等。 
 但在研究過(guò)程中，研究者們必須事先用基因技術(shù)進(jìn)行熒光素酶基因標(biāo)記，或者某種熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。目前活體光學(xué)成像系統(tǒng)的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不僅為客戶提供先進(jìn)的儀器，也提供具體實(shí)驗(yàn)所需的整套解決方案，包括試劑、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、特殊用途的質(zhì)粒、細(xì)胞株、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞處理和動(dòng)物處理設(shè)施等配套技術(shù)支持。出色的多任務(wù)處理能力，人性化的整體設(shè)計(jì)，便捷的操作系統(tǒng)，使實(shí)驗(yàn)室影像分析領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。

 下面以研究干細(xì)胞活體移植后的存活率為例，簡(jiǎn)介一兩種內(nèi)源性熒光色素標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)方法，供專業(yè)人士參考。

用熒光色素DiD標(biāo)記 間充質(zhì)干細(xì)胞 
1. 先用胰蛋白酶消化待標(biāo)記材料，使之成為一定密度的懸浮液；
2. 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細(xì)胞，吸取含原有培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行標(biāo)記；
3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液）清洗細(xì)胞，吸去PBS， 鈣鎂離子會(huì)影響胰蛋白酶的活性，必須小心；
4. 加入預(yù)熱的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶為例，每瓶加5ml， 確保瓶的表面被完全覆蓋；
5. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 C 孵育約 5 分鐘；
6. 然后在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)完全分散，如果有細(xì)胞貼壁情況，輕拍若干次或延長(zhǎng)孵育時(shí)間直至酶解消化完全成功；
7. 加入等量含 10% FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；
8. 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；
9. 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；
10. 400 RCF離心5 分鐘；
11. 小心移去上清液，不要擾動(dòng)細(xì)胞；
12. 將細(xì)胞重新懸浮于DMEM 并進(jìn)行計(jì)數(shù)；
13. 需要待標(biāo)記細(xì)胞在無(wú)血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106 /ml ；
14. 每ml細(xì)胞懸浮液加入5 L DiD 染色液；
15. 用移液器將染色液與細(xì)胞懸浮液混合均勻；
16. 在6孔低附著性細(xì)胞板上37 C 孵育20分鐘；
17. 孵育完全后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；
18. 400 RCF離心5 分鐘； 
19. 小心移去染色液，不要擾動(dòng)細(xì)胞；
20. 用PBS清洗細(xì)胞，用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；
21. 重復(fù)洗三次；
22. 細(xì)胞重新計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性；
23. 可以進(jìn)行活細(xì)胞成像了！

用熒光色素ICG標(biāo)記 人胚胎干細(xì)胞 
1. 必須先準(zhǔn)備好吲哚菁綠溶液（血容量、心輸出量、肝功能測(cè)定劑）作為對(duì)照品 ，然后使之與轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白（抗凝血作用）混合；
2. 測(cè)出1ml吲哚菁綠溶液的活力，然后在100 L DMSO中溶解ICG； 
3. 向混合物中加入 400 L Dulbecco的改良Eagles 培養(yǎng)基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震蕩均勻，吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml；
4. 加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白，魚精蛋白作為對(duì)照品的載體，使之能夠有效進(jìn)入細(xì)胞；
5. 在300 L ICG 和 300 L 無(wú)血清Dulbecco改良 Eagles 培養(yǎng)基中混入 5 L 硫酸魚精蛋白溶液, 使之終濃度為 10mg/ml,；
6. 震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物，標(biāo)記溶液制備完畢；
7. 從 hESC 10mm Petri 培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基；
8. 加入5ml預(yù)熱的 DMEM；
9. 加入制備好的魚精蛋白/ICG 溶液， 37 C下孵育1h；
10. 孵育完全后移去染色液；
11. 用5 ml PBS漂洗培養(yǎng)皿以清除染色液；
12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 C下孵育5分鐘使之酶解，適當(dāng)震搖培養(yǎng)皿效果會(huì)更好；
13. 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散；
14. 加入等量含 10% KSR的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；
15. 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中，400 RCF離心5 分鐘；
16. 在全培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞；
17. 如果還有細(xì)胞團(tuán)塊，可以移去原有培養(yǎng)基用10ml預(yù)熱的全ESC培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，重復(fù)酶解再離心；
18. 在這一點(diǎn)上，鼠源飼喂細(xì)胞需從hESCs中分離；
19. 然后將細(xì)胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm 培養(yǎng)皿中；
20. 37 C 孵育 45 分鐘，注意不要晃動(dòng)培養(yǎng)皿，如此鼠源飼喂細(xì)胞會(huì)貼壁而干細(xì)胞保持懸??； 
21. 從Petri 培養(yǎng)皿中移出已標(biāo)記的單細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞懸浮液；
22. 細(xì)胞重新計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性；
23. 可進(jìn)行活細(xì)胞成像了！

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