[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯

通過本實(shí)驗(yàn)，掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的方法和技術(shù)

       [實(shí)驗(yàn)原理]

        細(xì)菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。其原理是細(xì)菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。

       [實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]

1．超凈工作臺 2.低溫離心機(jī)

3. 恒溫?fù)u床 4.電熱恒溫培養(yǎng)箱

5. -70℃ 6. 恒溫水浴器

       [實(shí)驗(yàn)材料]

1.氯化鈣(CaCl2) 2.胰蛋白胨

3.酵母提取物 4.氯化鈉(NaCl)

5.氨芐青霉素 6.大腸桿菌DH5

7.pUC19質(zhì)粒 8. 50ml離心管

9.吸頭、培養(yǎng)皿、錐形瓶等

       附試劑的配制：

1. 0.1mol/L CaCl2溶液

2. LB液體培養(yǎng)基

配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g

酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g

NaCl 10g

搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至總體積為1L,121℃濕熱滅菌20min。

3．氨芐青霉素（Amp）,用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。

       [實(shí)驗(yàn)步驟]

1．從大腸桿菌DH5 平板上挑取一個單菌落接于2ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

2．取0.5 ml菌液轉(zhuǎn)接到一個含有50ml LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中, 37℃振蕩培養(yǎng)2-3h.(此時,OD600 =0.5,細(xì)胞數(shù)務(wù)必 108/ ml,此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵).

3.將菌液轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中,冰上放置10min.

4.離心10min(4000rpm),回收細(xì)胞.

5.倒出培養(yǎng)液,將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡.

6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml懸浮沉淀,立即放在冰上保溫30min。

7．0-4℃6000rpm，離心10min，回收細(xì)胞。

8．用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml懸浮細(xì)胞 。（務(wù)心放冰上）

9．分裝細(xì)胞，每200 l一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。

10．取200 l新鮮配制的感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA 2 l（50ng）混勻，冰上放置30min。

       同時做兩個對照管：

受體菌對照：200 l感受態(tài)細(xì)胞+2 l無菌水

質(zhì)粒對照：200 l 0.1mol/L CaCl2溶液+2 l質(zhì)粒DNA溶液

11．將管放到42℃循環(huán)水浴1-2min。

12．冰浴2min.

13．每管加800 l LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h(慢搖)。

14．將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上。

15．倒置平皿在電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)12-16h，出現(xiàn)菌落。

[實(shí)驗(yàn)安排]

15學(xué)時

第1天下午 第2天上午：配LB培養(yǎng)基，接種，液體培養(yǎng)

第2天上午、下午：繼續(xù)培養(yǎng)2-3h,制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)12-16h

第3天上午：觀察結(jié)果

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