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流體剪切力實(shí)驗(yàn)_91化工儀器網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-09-02  來(lái)源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):201
核心提示:流體剪切力實(shí)驗(yàn):流體環(huán)境下的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng),真實(shí)還原體內(nèi)環(huán)境這里我們以HUVEC細(xì)胞為例,使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)流體條件下的細(xì)胞培養(yǎng)與靜置狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。一.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備細(xì)胞:HUVECs細(xì)胞系培養(yǎng)基:EndothelialCellGrowthMedium(PromoCell,Germany,C-22010)胎牛血清培養(yǎng)耗材:ibidi單通道載玻片 -SlideI0.6Luer(ibidi,Germany,80186)灌流管,15cm,1.6mm直徑(ibidi,G

流體剪切力實(shí)驗(yàn):流體環(huán)境下的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng),真實(shí)還原體內(nèi)環(huán)境

 

這里我們以HUVEC細(xì)胞為例,使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行一個(gè)流體條件下的細(xì)胞培養(yǎng)與靜置狀態(tài)下的細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

 

一.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

細(xì)胞: HUVECs細(xì)胞系培養(yǎng)基:Endothelial Cell Growth Medium(PromoCell,Germany,C-22010)

 胎牛血清

培養(yǎng)耗材:ibidi單通道載玻片 -Slide I0.6 Luer (ibidi,Germany,80186)

 灌流管,15cm,1.6mm直徑(ibidi,Germany,10962)

 封口夾 

儀器設(shè)備:ibidi流體剪切力系統(tǒng),含空氣泵(ibidi,Germany,10905)和流體單元(ibidi,Germany,10903)

 

實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天,請(qǐng)將所有需要使用的試劑,培養(yǎng)基,通道載玻片,灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置到第二天,排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

 

一.)培養(yǎng)細(xì)胞

準(zhǔn)備HUVECs細(xì)胞系,按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。好使用比較健康的內(nèi)皮細(xì)胞,以防在做流體實(shí)驗(yàn)時(shí)候細(xì)胞不能穩(wěn)定貼壁。我們建議使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基+10%FCS培養(yǎng)HUVEC。好使用4代以內(nèi)的HUVEC。已獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

按照下面流程鋪細(xì)胞:

將150 l的1.6 x 106 cells/ml密度的細(xì)胞懸液加入通道載玻片中,注意,將移液器頭插入注液孔中再加入細(xì)胞懸液,可以輕微傾斜通道載玻片幫助細(xì)胞懸液充滿整個(gè)通道(圖一)。

?

2.蓋上注液孔蓋,將通道載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時(shí),等待細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后,拿出通道載玻片,在每個(gè)注液孔中分別加入60 l培養(yǎng)基,注意,槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基(圖二)

3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)2-4小時(shí)左右,等到細(xì)胞剛剛長(zhǎng)滿為單細(xì)胞層,即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)(圖三)。注意,要使用單層細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn),使每個(gè)細(xì)胞均受到均勻的剪切力。

 

                                                                           圖三

3.靜置條件下細(xì)胞培養(yǎng)。在通道載玻片中靜置培養(yǎng)的細(xì)胞可以作為流體剪切力條件下培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照。待流體實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的同時(shí),將靜置細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)照組放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行7天的培養(yǎng)。注意,培養(yǎng)過(guò)程中每天都要更換培養(yǎng)基。

 

二)搭建流體系統(tǒng)

將灌流管按照說(shuō)明放在置在流體單元上。在灌流管的儲(chǔ)液管中加入12ml培養(yǎng)基。這時(shí)不需要連接通道載玻片。實(shí)驗(yàn)前需要去除整個(gè)灌流管中的氣泡,存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會(huì)影響剪切力的大小,有時(shí)還會(huì)使灌流系統(tǒng)中的液體流動(dòng)停滯。打開(kāi)ibidi泵控制系統(tǒng),在任務(wù)欄中找到 Remove air bubbles ,ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動(dòng)運(yùn)行下面任務(wù),用于去除氣泡。(表一)

 

2.連接通道載玻片。去除氣泡后,就可以將之前準(zhǔn)備好的含貼壁細(xì)胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下,放到超凈臺(tái)中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過(guò)滿狀態(tài)(?)。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片(圖四)。

圖四:a)封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b)將其中一個(gè)魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j)按圖示,將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連,注意不能產(chǎn)生氣泡,會(huì)有部分培養(yǎng)基溢出。k)連接好后,將封口夾移除,用無(wú)塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l)全部連接好后,用顯微鏡觀測(cè)一下通道內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)。

3)檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門(mén)。將封口夾夾住其中一根硅膠管,如果兩邊的灌流儲(chǔ)液管液面不會(huì)下降或者上升,那么,整個(gè)系統(tǒng)就是密封的,并且是正確安裝的(圖五)。

                                                       圖五。

4.開(kāi)始流體剪切力實(shí)驗(yàn)(單向?qū)恿鳎⒋罱ê玫牧黧w單元與流體剪切力泵相連后,將整個(gè)流體單元放入二氧化碳培養(yǎng)箱中。打開(kāi)控制軟件,設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件與步驟。為了使貼壁細(xì)胞適應(yīng)剪切力培養(yǎng)環(huán)境。先用低剪切力刺激,逐步提高并且保持在一定的剪切力(表二)。

?

 

三 )實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一.形態(tài)對(duì)比
在培養(yǎng)7天之后,可以直接用顯微鏡觀察到細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化,在剪切力刺激下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)更加修長(zhǎng),排列更加緊密和規(guī)律。而靜置狀態(tài)下培養(yǎng)了7天的細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有顯著的變化(圖六)。

圖六:如上所示,在20 dyn/cm2刺激下的細(xì)胞更為修長(zhǎng)排列更加緊密。

 

免疫熒光實(shí)驗(yàn)去除通道內(nèi)培養(yǎng)基。用1mlPBS沖洗通道,在注入PBS的同時(shí),用槍頭從另一個(gè)注液孔吸出廢液。加入約200 l的3.7%多聚甲醛的PBS溶液,用槍頭從另一個(gè)注液孔吸出廢液。靜置10分鐘。按照步驟1)沖洗通道加入200 l 1% Triton  X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘按照步驟1)沖洗通道加入200 l 1% BSA的PBS溶液封閉20分鐘按照步驟1)沖洗通道依次加入一抗,二抗進(jìn)行免疫熒光染色后,沖洗通道并加入封片液進(jìn)行顯微鏡觀察(圖七、圖八)。

圖七:HUVEC細(xì)胞在20 dyn/cm2刺激7天的免疫熒光結(jié)果??梢钥吹郊?xì)胞骨架排列方向非常一致。藍(lán)色:細(xì)胞核;綠色:VE- cadherins;紅色:actin filaments

 

圖八:靜置狀態(tài)下培養(yǎng)7天的HUVEC細(xì)胞,可以看見(jiàn)細(xì)胞骨架排雷沒(méi)有規(guī)律性,并且表達(dá)量也略少。

三.實(shí)驗(yàn)總結(jié)
綜上所述,對(duì)于HUVEC細(xì)胞而言,流動(dòng)剪切力的培養(yǎng)環(huán)境更為貼近其自然生長(zhǎng)的環(huán)境,我們實(shí)驗(yàn)說(shuō)明在靜置狀態(tài)下并不能展現(xiàn)出HUVEC細(xì)胞的生理特性。


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