導(dǎo)語
我們常說,科學(xué)家也是藝術(shù)家,在明確真理探索科學(xué)的道路上,往往會(huì)創(chuàng)造出很多美感的藝術(shù)作品。所以今天小編為大家介紹的就是能做出美美圖的新技能。
先欣賞一下美美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖~
---Olson, B. D. and Downes, G. B.
---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos
接下來為大家介紹能做出這種美美圖的新技能,原位雜交實(shí)驗(yàn)~
基本原理
簡單點(diǎn)說就是堿基互補(bǔ)配對原則。來講的話,就是我們將外源核酸(也就是常說的分子探針)與組織、細(xì)胞上待檢測的DNA或RNA進(jìn)行配對,形成核酸雜交分子,再經(jīng)過一定手段將這個(gè)雜交分子的位置顯示出來。
實(shí)驗(yàn)技術(shù)的更新是很快的,在明確了該技術(shù)的可行性后,科學(xué)家進(jìn)一步改進(jìn)并進(jìn)行分類,主要有以下幾類:
熒光原位雜交技術(shù):DNA分子原位雜交技術(shù);在原技術(shù)手段上增加了熒光元素,技術(shù)手段較為先進(jìn),易掌握,運(yùn)用廣泛,一會(huì)兒小編會(huì)著重介紹哦~畢竟,能夠在我們自己的實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用上,才是我們的zui終目標(biāo)嘛。
多彩色熒光原位雜交技術(shù):顯而易見,是熒光原位雜交的升級(jí)版,采用多個(gè)熒光來檢測,目前的發(fā)展及運(yùn)用也是較多的。
原位PCR:將原位雜交結(jié)合PCR技術(shù)發(fā)展起來的實(shí)驗(yàn)方法。說實(shí)話,了解的比較少,我就不班門弄斧了,呵呵。
基因組:該技術(shù)在我們的領(lǐng)域可能運(yùn)用的畢竟少,主要是根據(jù)物種DNA同源性差異實(shí)現(xiàn),在農(nóng)作物等的雜交育種上運(yùn)用較廣,我就不詳細(xì)介紹啦~
明確了以上的分類及原理后,接下來小編主要講講在我們的領(lǐng)域中運(yùn)用較廣的熒光原位雜交方法。
結(jié)合示意圖可以更好的理解哦
實(shí)驗(yàn)材料(重要的,基礎(chǔ)材料不贅述)
1.4%多聚甲醛(1x PBS配置):固定劑
2.蛋白激酶K:使得靶核酸暴露,增加探針和靶核酸結(jié)合。
3.雜交緩沖溶液
實(shí)驗(yàn)步驟
取材:動(dòng)物組織取材(小鼠采用心臟灌流法)后在4%的多聚甲醛中固定4小時(shí)左右, 1x PBS洗5次,每次30分鐘,用25%蔗糖脫水過夜(均在4 進(jìn)行)。樣品做OTC冰凍切片,厚度16 mM,收集在載玻片上,冷凍于-20℃。
1. 原位雜交:
(1)取出玻片,在50℃預(yù)熱15 min,放入原位雜交盒中,加入新鮮配制的4%多聚甲醛,室溫固定30分鐘,DEPC-PBS洗三次。用10 g/ml的蛋白激酶K處理組織10~15 min,DEPC-PBS洗三次。
(2)4%多聚甲醛,室溫固定15 min,用水洗一遍后,加入預(yù)雜交液置于65℃烘箱內(nèi)。 4h后,回收預(yù)雜交液,加入含1-2 g/ml探針的雜交液, 65℃過夜。
(3)次日,用65℃的2 SSC洗滌5 min, 2-3次。將載片轉(zhuǎn)移至玻璃固定盒中65℃加入攪拌子攪拌15 min,加入RNaseA 0.2 g/ml, 37℃ 30 min。 65℃的1 SSC沖洗一次,再用0.2 SSC洗滌3次, 每次30 min。
(4)室溫下,用含15%的羊血清封閉載片1h。滴加生物素化鼠抗地高辛,室溫2h。 PBT洗滌3次,每次30 min。 用新鮮配制的堿性磷酸酶液洗滌3次,每次5 min。加入含有50 g/ml的NBT和BCIP的堿性磷酸酶液孵育過夜。
(5)觀察信號(hào),如果信號(hào)足夠強(qiáng),用多聚甲醛停止試驗(yàn),用甘油封片,采集圖片。
來源:弗雷賽斯
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