基因槍法轉(zhuǎn)化大麥實驗步驟，1. 組織培養(yǎng)基的準備

( 1 ) 首先準備所需濃度 2 倍的植物凝膠，高壓滅菌（見注 2 ) 。

( 2 )  所有的組織培養(yǎng)基都要過濾滅菌，因此除了無菌的儲備液，其他培養(yǎng)基成分按所需濃度 2 倍的量混勻，調(diào)到合適的 pH 后過濾滅菌（使用瓶頂過濾器、0.22 m 微孔濾膜）。

( 3 ) 使用前將 2x 凝膠和 2x 培養(yǎng)基在水浴鍋中加熱至 60℃。

( 4 ) 將所需儲備液在無菌條件下加入到熱的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基和植物凝膠混合后倒入 9 cm 培養(yǎng)皿中（Sterilin)。

( 5 ) 分化培養(yǎng)時，使用高培養(yǎng)皿（100 mmx 20 mm，F(xiàn)alcon) 。

( 6 ) 滲透處理時，使用 5 cm 小培養(yǎng)皿 （Sterilin) 。

2. 幼胚的分離

(1) 幼穗的采收與消毒

① 當幼胚直徑長到 1~2 mm 時米收麥穗（見注 3) 。

② 在取麥穗之前，從每一穗中間取一粒種子，查看幼胚的大小，確保達到所需的要求 [ 可參考第 9 章「農(nóng)桿菌介導的大麥轉(zhuǎn)化方法」，圖 9.2 (a ) ~（c ) ] 。

③ 將種子從穗子上取下來，去芒，但不要破壞種殼。

④ 先用 70% 的乙醇沖洗 30s，再用蒸餾水沖洗 3 遍，然后在次氯酸鈉（Fluka 71696) 與水比例為 50：50 的溶液中浸泡 4 min，再用蒸餾水沖洗 4 遍 ，zui后將水倒掉但保持種子濕潤，置于無菌的螺口瓶中待用。

(2) 分離幼胚摘除胚軸

基因槍法轉(zhuǎn)化大麥實驗步驟，所有的操作均在超凈臺中進行：

① 每次大約取 20 粒無菌種子，置于解剖鏡無菌的藍色或黑色底板上，用一只鑷子固定種子，另一只懾子剝出幼胚，去除胚軸（見注 4) 。

( 2 ) 每皿愈傷誘導培養(yǎng)基放 25~30 枚幼胚，盾片朝上，25℃ 暗培養(yǎng)。

3. 制備 DNA 包裹的金粉微粒

(1) 制備金粉母液

DNA 包裹金粉微粒的方法與文獻 [ 9 ] 中的方法相似

① 稱 40 mg 金粉于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 100% 乙醇。

② 渦旋振蕩使金粉充分混勻，離心使其沉淀。

③ 倒掉乙醇，重復步驟 2 兩次。

④ zui后一次離心后，去除乙醇，加入 1 ml 無菌水渦旋振蕩使之重懸。

⑤ 將金粉以 50 l 分裝于無菌的 EP 管中，分裝時注意不斷混合以保持金粉顆粒處于懸浮狀態(tài)，分裝后保存在 -20 C 。

(2) 亞精胺制備

① 將裝有 1 g 亞精胺（Sigma- Aldrich) 的瓶子置于 65 C 水浴鍋中加熱使之融化。

② 用移液槍取 14 l 溶液分裝于無菌的 1.5 ml 離心管中，-20℃ 儲存待用。

(3) 金粉微粒的包裹

① 從冰箱中取出亞精胺，并使其解凍。

② 加入 986 l 無菌水，渦旋振蕩混合。

③ 用 1 ml 過濾器和小的過濾器濾頭（Minisart 0.2 m 過濾器，Sartorius) 將溶液過濾到無菌的 1.5 ml 離心管中，制成 0.1 mol/L 亞精胺溶液。

④ 從冰箱中取出一管 50 l 的金粉并使之解凍。

⑤ 沿裝有金粉的離心管管壁，加入 5 l DNA ( 1 g/ l) ，立即渦旋振蕩使金粉和 DNA 充分混合（見注 5) 。

⑥ 然后將 50 l  2.5 mol/L CaCl2 和 20 l 0.1 mol/L 亞精胺加入到離心管管蓋中，蓋好蓋子，顛倒離心管使 CaCl2 和亞精胺與金粉顆?；旌希嵉闺x心管之前不能讓 CaCl2 和亞精胺與金粉顆?；旌希?，立刻渦旋振蕩使所有組分充分混合。

⑦ 管子在冰上放置 1 min，然后于 1957 g 離心不超過 30 s，使金粉沉淀。

⑧ 去除上清液，加入 250 l 100% 乙醇，用槍頭輕輕吹打混勻，然后渦旋振蕩，這個過程是洗滌包埋了 DNA 的金粉微粒。

⑨ 1957 g 離心不超過 30 s 沉淀金粉微粒，去除上清，加入 60 l 100% 乙醇。

⑩ 渦旋振蕩重懸金粉顆粒。DNA 包埋的金粉微粒即微載體已制備完畢。

4. 粒子轟擊幼胚

(1) 幼胚滲透處理

轟擊前，取分離 1 天后的幼胚，放在高滲培養(yǎng)基中處理 4 h。每皿 20~30 枚幼胚，置于培養(yǎng)皿中心 1.6 cm2 范圍內(nèi)，盾片朝上。胚可以放得緊密一些，但相互之間不要碰到。轟擊之后幼胚繼續(xù)高滲處理 16 h。

(2) 基因槍準備

① 基因槍所有組件和內(nèi)部的槍體都要用 100% 乙醇清洗消毒。終止屏和載體膜浸泡在乙醇中消毒，然后晾干。破裂盤在用之前浸泡在異丙醇中，無需再消毒。

② 載體膜晾干后，先放入載體膜支架，然后吸取 3.5 l 包裹了 DNA 的金粉微粒點到每張載體膜中央。吸取金粉微粒時注意保持懸浮狀態(tài)。

(3) 基因槍參數(shù)

基因槍的各個組件在轟擊室的位置如下：

破裂盤和載體膜之間的距離：2.2 cm

載體膜和終止屏之間的距離：1.3 cm

終止屏和樣品架之間的距離：5.8 cm  (槍體基部往上第三擋）

真空度：28 in.Hg.

(4) 粒子轟擊

① 在轟擊幼胚之前，基因槍先空轟擊兩次（見注 6) 。

② 將 1100 psi 的破裂盤在異丙醇中浸泡后放置在破裂盤固定帽內(nèi)，然后將固定帽連接到基因槍腔體內(nèi)的氮氣氣體加速管，基部旋緊。

③ 將終止屏放入微載體發(fā)射組件中，然后把點有金粉微粒并已干燥的載體膜放入載體膜支架，安裝在固定槽中（載體膜有金粉微粒的一面朝下），旋上蓋子，將微載體發(fā)射組件放在破裂盤固定帽下面的位置上。

④ 把放有幼胚的培養(yǎng)皿放在樣品架上，樣品架置于從轟擊室底往上數(shù)的第三擋上，拿走培養(yǎng)皿蓋，關上轟擊室門，抽真空使真空度達到 28 in.Hg 后保持，然后轟擊。

⑤ 當真空釋放后，打開轟擊室門，放回培養(yǎng)皿蓋，準備下一次轟擊。

⑥ 轟擊后的幼胚在 25 C 暗培養(yǎng)。

5. 轉(zhuǎn)化子篩選

( 1 ) 轟擊后 16 h，將幼胚從高滲培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有 5 mg/L 雙丙氨膦的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行選擇，25℃ 暗培養(yǎng)。

( 2 ) 每隔兩周更換一次含有 5 mg/L 雙丙氨膦的愈傷組織誘導培養(yǎng)基。

( 3 ) 選擇培養(yǎng) 4 周后，即第二次更換培養(yǎng)基時，將來源于同一個幼胚的愈傷組織分成 3~6 個小塊，并做好標記，保證來源于同一個幼胚的所有愈傷組織在一起。

( 4 ) 選擇培養(yǎng) 6 周后，即第三次更換培養(yǎng)基時，將剩余健康的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有 1 mg/L 雙丙氨膦的過渡培養(yǎng)基中，在 25℃ 弱光下培養(yǎng)，即把培養(yǎng)皿放到有光照的組織培養(yǎng)室中，在每個培養(yǎng)皿上蓋一張薄紙片。

基因槍法轉(zhuǎn)化大麥實驗步驟，6. 轉(zhuǎn)基因植株再生

( 1 ) 在過渡培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，將來源于同一個幼胚的組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上（圖 8.2) 。用深度大的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基不加任何生長調(diào)節(jié)劑，只含有 1 mg/L 雙丙氨膦。每 2 周用同樣的培養(yǎng)基進行繼代，直到不再有新的再生苗長出。

( 2 ) 當幼苗的芽長到 2~3 cm，也形成根時，從培養(yǎng)皿中移出轉(zhuǎn)移到含有 12 ml 愈傷誘導培養(yǎng)基的玻璃試管（Sigma C-5916) 中。培養(yǎng)基不加任何生長調(diào)節(jié)劑，只含有 1 mg/L 的雙丙氨膦。

( 3 ) 當長根的幼苗長到試管頂部，就可以轉(zhuǎn)移到土壤中。用長鑷子輕輕地將幼苗從試管中移出，根部的組織培養(yǎng)基用水沖洗干凈。

( 4 ) 將幼苗用同樣的大麥生長介質(zhì)種在直徑為 5 cm 的盆中，幼苗上面蓋一個有孔的塑料杯以保持濕度，直到幼苗在土壤中定植良好。

( 5 ) 當幼苗在土壤中扎根后，就可以采集葉片分析目的基因是否存在。雙丙氨膦選擇不像潮霉素選擇那樣（詳見第 9 章 「農(nóng)桿菌介導的大麥轉(zhuǎn)化方法」），一些非轉(zhuǎn)化的植株也可能存活。

( 6 ) 快速簡易的檢測再生植株轉(zhuǎn)化狀態(tài)的方法是用葉片進行除草劑抗性測試 [8]。

7. 用基因槍進行瞬時檢測

基因槍轟擊的一個重要用途是進行瞬時分析，常用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化前對載體的檢測。在瞬時分析時，裝有幼胚的培養(yǎng)皿一般轟擊兩次以提高 DNA 的轉(zhuǎn)化量，建議在兩次轟擊間以 90 角轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿（見注 7 ) 。圖 8.3 ( a ) 和圖 8.3 ( b ) 分別是用含有葡萄糖苷酸酶基因( gus ) 和綠色突光蛋白基因（gfp）的金粉微粒轟擊幼胚后進行瞬時表達的兩個示例。

關注本網(wǎng)官方微信 隨時閱讀專業(yè)資訊