Western blot基本原理

在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來(lái)檢測(cè)。

Western blot的中文名稱(chēng)是：蛋白質(zhì)印跡,也叫免疫印跡（immunoblotting)。是分子生物學(xué)中常用的三種印跡技術(shù)之一。目前公認(rèn)的該實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)明人為美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治 斯塔克（George Stark）。

Western blot 蛋白質(zhì)印跡

Southern blot DNA印跡

Northern blot RNA印跡

Western blot 優(yōu)點(diǎn)

高分辨率的電泳技術(shù)

特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western blot應(yīng)用

目的蛋白的表達(dá)特性分析

目的蛋白與其它蛋白的互作

目的蛋白的組織定位

目的蛋白的表達(dá)量分析

Western blot 流程一、蛋白樣品的提取

提取細(xì)胞中的蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理。其中裂解液應(yīng)該新鮮制備，加入少量的蛋白酶抑制劑以減少蛋白的降解，并且分裝凍存于-80℃，蛋白酶抑制劑的種類(lèi)很多，要根據(jù)具體情況選擇。

目的：要獲得高豐度、高品質(zhì)的蛋白質(zhì)，以滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。

二、蛋白樣品的定量

Western blot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必須盡量使各組之間總蛋白量基本一致;

蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定; 蛋白質(zhì)含量太高則會(huì)使帶形扭曲,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪Α?/p>

目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。

三、蛋白樣品的變性

1M Tris-HCl(pH6.8)

10 ml

1M  DTT

20 ml

SDS

4 g

甘油

20 ml

溴酚藍(lán)

0.2 g

總體積

100ml

全部配好分裝，-20℃凍存。

按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95～100℃加熱5～15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25 l，總蛋白量20～50 g。

SDS：

陰離子去污劑  變性劑

氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。

蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。

與強(qiáng)還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，使蛋白質(zhì)分子線(xiàn)性化。

蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：

不連續(xù)的電泳緩沖體系。

SDS 蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時(shí)，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠配制及蛋白分離范圍

灌膠
灌制分離膠 隔絕空氣 灌制濃縮膠  插入梳子 

四、電泳

加足夠的電泳液后開(kāi)始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過(guò)內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品（Marker： 5-10ul ；樣本：10 ul ）。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

采用恒壓的方法：1.恒壓60V，至樣本跑過(guò) 濃縮膠；2.將電壓調(diào)至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，準(zhǔn)備進(jìn)行進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

五、轉(zhuǎn)膜

凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC （硝酸纖維素）膜、尼龍膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。

選擇膜的主要根據(jù)有：

1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量）

2.膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?/p>

3.不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適合用于所選顯色方法，信噪比好）

4.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜

濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備濾紙和1張轉(zhuǎn)印膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。轉(zhuǎn)膜前，轉(zhuǎn)印膜以及濾紙均需浸潤(rùn)在電轉(zhuǎn)液中活化15-20min（其中PVDF膜需在無(wú)水甲醇中活化30min后再浸潤(rùn)于電轉(zhuǎn)液中，且濾紙應(yīng)與膠和膜的大小一致）。

將玻板輕輕撬開(kāi)，將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉(zhuǎn)液中。從陰極到正極，按照三層濾紙  凝膠 轉(zhuǎn)印膜 三層濾紙的順序制成 三明治 （濕轉(zhuǎn)在三明治的兩側(cè)各加一層活化過(guò)的海綿，同時(shí)應(yīng)注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡）。

半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

六、轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)

轉(zhuǎn)完后將膜用1 麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白，將膜晾干備用。

將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察凝膠中的蛋白是否完全轉(zhuǎn)至印跡膜上。

七、封閉，結(jié)合一抗，結(jié)合二抗。

封閉

為避免作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。

5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）

Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。

一抗孵育

把膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。

二抗孵育

加入二抗，搖床上緩慢搖動(dòng)，于室溫孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

用TBST漂洗膜3次，每次10min。

最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。

八、固相免疫檢測(cè)

利用ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）發(fā)光檢測(cè)目的蛋白。

ECL試劑采用氧化還原反應(yīng)的原理：

發(fā)光液A和B分別是魯米諾和過(guò)氧化氫，在辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的催化作用下,魯米諾與過(guò)氧化氫反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會(huì)產(chǎn)生熒光。

九、Western blot結(jié)果分析

目的蛋白的灰度值除以?xún)?nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

內(nèi)參的選擇

內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，一般要選擇一個(gè)在處理因素作用的條件下蛋白含量不會(huì)發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。

內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義,表明的確是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化。

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