熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)的詳細(xì)介紹：

熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測(cè)組織中的DNA或RNA序列，那他能不能檢測(cè)microRNAs呢？提到miRNAs，我們首先想到的是他們非常小，確實(shí)它們是很短的單鏈RNA分子，只有18-23個(gè)核苷酸。由于他們很小，所以對(duì)FISH技術(shù)的可行性有很多擔(dān)憂，比如探針能否具有足夠的敏感性和特異性，什么樣的探測(cè)系統(tǒng)適合于來自這些短的目標(biāo)序列的信號(hào)等等。

miRNAs在FFPE組織中的完整性

很有趣的是，研究表明相比于mRNAs, miRNAs在福爾馬林固定的石蠟包埋組織(FFPE)中能夠更好地保存。正是因?yàn)樗麄兊捏w積小, 可以和大的蛋白復(fù)合物緊密結(jié)合，使得它們能夠忍受這個(gè)過程。不過，需要一直保持沒有RNAse污染的環(huán)境，經(jīng)常我們會(huì)使用DEPC水來準(zhǔn)備溶液。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)需要的任何器具都需要提前進(jìn)行高壓滅菌。

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)抗原修復(fù)

經(jīng)過福爾馬林固定交聯(lián)會(huì)限制探針和試劑，使它們不能接近目的miRNAs，可以用抗原修復(fù)術(shù)來暴露這些位點(diǎn)。大多數(shù)protocols會(huì)使用含有蛋白酶K的 tris緩沖液中來打破甲醛交聯(lián)，也有一些報(bào)告，蛋白酶K可能會(huì)破壞一些抗原表位，建議在檸檬酸緩沖中加熱樣本。這兩種方法都會(huì)有效, 可以探索哪種更適合自己的樣本。

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)探針選擇

曾經(jīng)有人探索使用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行miRNAs的FISH實(shí)驗(yàn)，但由于目標(biāo)序列太短，雙鏈穩(wěn)定性差，而且與緊鄰的相關(guān)miRNAs有很高的序列相似性，使得很難達(dá)到足夠的特異性?，F(xiàn)在我們通常使用表現(xiàn)更好的Locked DNA(LNA)探針來實(shí)現(xiàn)這一過程。

Locked DNA是一類DNA類似物，糖環(huán)上被鎖定在一個(gè)亞甲基橋，使得探針在N構(gòu)象穩(wěn)定，因此LNA探針是結(jié)合的佳選擇， 它們?cè)诟叩臏囟认聦?shí)現(xiàn)更高的親和力和穩(wěn)定性。完全匹配的雙鏈和錯(cuò)配之間所需溫度不同，所以更容易找到一個(gè)雜交溫度可以只檢測(cè)的完美匹配,而且，LNA/miRNA雜交體可以抵抗核酸酶的攻擊。

對(duì)照探針

確保使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照探針,特別是設(shè)置程序時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照是檢測(cè)存在于特定組織中的miRNA，陰性對(duì)照設(shè)置兩個(gè)探針，其中一個(gè)含有兩處錯(cuò)配，另一個(gè)是針對(duì)你所要檢測(cè)的組織中已知的不會(huì)表達(dá)的miRNA具有特異性。如果你難以區(qū)分背景噪音的信號(hào),你應(yīng)該還設(shè)置一個(gè) no probe 對(duì)照.

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)雜交和洗滌

先在50 C進(jìn)行兩個(gè)小時(shí)的預(yù)雜交，然后再與探針進(jìn)行雜交過夜，溫度也是在50 C. 之后進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌步驟，這是去除非特異性反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。洗滌是在SSC緩沖液中，先是在37 C進(jìn)行洗滌, 以去除多余的探針和雜交緩沖液，然后在50 C進(jìn)行振蕩洗滌，以消除非特異性和重復(fù)性的雜交。如果非特異性結(jié)合仍然是一個(gè)問題,試著重復(fù)洗幾次。如果你剛剛開始實(shí)驗(yàn)，可以探索下不同的雜交和洗滌溫度，可能上下兩度的的差異會(huì)帶來很大的不同。

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)探針標(biāo)記和信號(hào)檢測(cè)

市場(chǎng)上有很多種寡核苷酸標(biāo)記示蹤劑以供選擇。生物素被用作5 端耦合，適合進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。如果你的組織是豐富的內(nèi)源性生物素,dioxigenin應(yīng)該是你的第一選擇。結(jié)合anti-label抗體后,用辣根過氧化物酶系統(tǒng)將信號(hào)放大。還可以選擇一個(gè)合適的熒光基團(tuán)為HRP底物，常使用的是花青染料, Alexa系列或Quasar染料也是一種選擇。根據(jù)所需的ex/em，雙標(biāo)等選擇合適的標(biāo)記。

  熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)FFPE組織中miRNAs有很多優(yōu)勢(shì)，可以使miRNAs在復(fù)雜組織中的確定位置形象化地體現(xiàn)，可以進(jìn)行大量樣本的檢測(cè)。隨著科學(xué)發(fā)展，還可以同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)記的miRNA,以及多元miRNA FISH技術(shù)。無(wú)論在癌癥領(lǐng)域還是發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，miRNA研究都是具有無(wú)限潛力的！

  1對(duì)于熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)操作來說，那些因素比較重要？

在FISH中最重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強(qiáng)度，因此探針要避光保存，其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要精確達(dá)到要求，這也直接關(guān)系到FISH的穩(wěn)定性。

2 如何保證熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)操作中的溫度？

措施是使用一些FISH的專用儀器進(jìn)行操作，如Vysis的Hybrit FISH雜交儀。如果是手工操作，首先要對(duì)FISH操作過程中可能使用的一些儀器進(jìn)行溫控能力的檢查，如水浴鍋、孵箱，對(duì)其中不符合要求的要進(jìn)行更換（疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以內(nèi)）。其次，要盡可能地保持操作環(huán)境溫度在20度以上，對(duì)于在冬季進(jìn)行的FISH操作尤為重要。此外對(duì)于需要預(yù)熱以達(dá)到要求溫度的試劑，在使用前必須使用溫度計(jì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)溫。同時(shí)檢測(cè)的樣本好不能超過4塊。操作中的行動(dòng)一定要迅速。操作者還往往忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片。特別是在冬季，蓋玻片本身溫度就低，加之探針的量本就不多（10ul），因此事先沒有預(yù)熱的蓋玻片會(huì)使得雜交液的溫度急劇下降嚴(yán)重地影響了探針和目標(biāo)DNA的雜交效率。因此對(duì)上述小部件的要進(jìn)行預(yù)熱處理，不然會(huì)影響FISH的雜交效果。

3 使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果時(shí)，最初有清晰而明亮的信號(hào)，但隨后信號(hào)急劇衰減，幾分鐘后信號(hào)就消失了。這是探針本身的質(zhì)量問題嗎？

正常情況下，商業(yè)化探針即使是雜交后，如保存適當(dāng)，熒光信號(hào)能保持半年以上。出現(xiàn)上述情況主要的原因是操作觀察的過程中或是探針的保存過程中沒有采取嚴(yán)格的避光措施。陽(yáng)光或是強(qiáng)的燈光都會(huì)使熒光染料發(fā)生急劇的淬滅，從而造成了觀察結(jié)果的不穩(wěn)定。因此在操作和觀察時(shí)，盡可能在暗室中操作，也可以在封片觀察時(shí)加入一定的antifade（抗淬滅劑）以延緩熒光素的淬滅。

4 如何配制熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)各種試劑呢？

強(qiáng)烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑。此外，配制后使用pH計(jì)檢測(cè)是否符合要求。配制的各種試劑都要采用超純級(jí)要求。每次FISH使用新的試劑，舊的試劑好棄置不用。洗脫液和變性液當(dāng)天用當(dāng)天配。

5 熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針有何不同？

為什么我們要選擇直標(biāo)型探針？所謂的直標(biāo)型探針是指DNA探針共價(jià)連接熒光素基團(tuán)；間標(biāo)型探針則是指DNA探針先與某個(gè)半抗原連接，諸如生物素或，然后半抗原與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)，類似 三明治 的復(fù)合物。與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。

6 能對(duì)同一樣本進(jìn)行多次的熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)操作嗎？

在多數(shù)情況下，如果FISH操作沒有得到正常的結(jié)果，我們可以將探針洗去，然后使用同樣的探針進(jìn)行再次的雜交。如果我們使用的是直標(biāo)型探針，還可以使用不同探針對(duì)同一樣本進(jìn)行反復(fù)雜交。針對(duì)不同的樣本，處理方法略有不同。外周血樣本的處理： 1、使用鑷子小心地揭去雜交區(qū)的蓋玻片 2、將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。對(duì)于多次雜交，復(fù)染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。曾有報(bào)道在同一樣本片上進(jìn)行了多達(dá)8次的FISH操作。也可對(duì)已經(jīng)進(jìn)行G帶顯色的樣本片進(jìn)行FISH操作：將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。

8 熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)技術(shù)有哪些主要優(yōu)勢(shì)：

① 安全、快速、靈敏度高；

② 探針能較長(zhǎng)時(shí)間保存；

③ 多色標(biāo)記，簡(jiǎn)單直觀；

④ 可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；

⑤ 可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測(cè)。

  熒光原位雜交fish檢測(cè) 應(yīng)用在醫(yī)療行業(yè)：

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)(Florescence In-Situ Hybridization簡(jiǎn)稱FISH)是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。它將熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性，熒光信號(hào)的直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來，通過熒光標(biāo)記的DNA探針與待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì)染色體或基因異常的細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)。自20世紀(jì)80年代末，Pinkel和Heiles將FISH技術(shù)引入染色體檢測(cè)領(lǐng)域后，F(xiàn)ISH技術(shù)就在臨床診斷及科研工作中得到了廣泛的運(yùn)用，顯示出與一些傳統(tǒng)技術(shù)相比的明顯優(yōu)勢(shì)。

熒光原位雜交fish檢測(cè)與傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)法（IHC）相比，F(xiàn)ISH具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。目前免疫組織化學(xué)法正廣泛應(yīng)用于腫瘤等多個(gè)領(lǐng)域的臨床診斷。免疫組化的檢測(cè)對(duì)象是疾病相關(guān)的蛋白。由于蛋白的表達(dá)和本身的構(gòu)象受各種因素的影響很大（例如酸、堿和變性劑），檢測(cè)條件的穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。此外，免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判斷依賴于檢測(cè)者對(duì)顯色結(jié)果的主觀判斷，對(duì)于一些弱陽(yáng)性的結(jié)果，不同的檢測(cè)者容易產(chǎn)生分歧。上述的因素都可能影響醫(yī)生對(duì)病情的最終診斷。

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)檢測(cè)的對(duì)象是細(xì)胞中的DNA，致密的雙螺旋結(jié)構(gòu)使DNA可以歷經(jīng)千百萬(wàn)年而依然保持良好，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被環(huán)境條件影響，為熒光原位雜交技術(shù)的穩(wěn)定提供了良好的基礎(chǔ)。此外，熒光原位雜交結(jié)果的判定借助于對(duì)熒光的顏色判斷和信號(hào)計(jì)數(shù)，客觀地量化了檢測(cè)地結(jié)果。如果借助于相應(yīng)的FISH操作系統(tǒng)（例如Abbott-Vysis公司的Hybrit雜交儀和VP2000樣本預(yù)處理系統(tǒng)）和染色體成像系統(tǒng)（例如AI公司的CytoVision）就能實(shí)現(xiàn)整個(gè)FISH操作的自動(dòng)化，最大限度的降低操作者和檢測(cè)者的主觀因素，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

PCR由于靈敏度高，操作簡(jiǎn)便快捷是近年來應(yīng)用比較多的基因診斷技術(shù)，但PCR診斷技術(shù)的假陰性和假陽(yáng)性的比例較高，對(duì)同一樣本也只能作一次分析，不能重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著探針技術(shù)的不斷發(fā)展，F(xiàn)ISH目前的靈敏度已經(jīng)接近或達(dá)到PCR的水平，并能很好彌補(bǔ)PCR技術(shù)的局限。熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)不僅有極低的假陽(yáng)性、假陰性的比例（以Abbott-Vysis的產(chǎn)前診斷探針為例，29,000例的使用結(jié)果證實(shí)正確率高達(dá)99.9％），還能對(duì)同一樣本進(jìn)行多次的FISH操作以及利用不同顏色的熒光探針一次檢測(cè)多個(gè)染色體或基因的異常，大大節(jié)省了檢測(cè)的時(shí)間。此外，通過FISH可以對(duì)染色體或特定基因的數(shù)目異常，特定片斷的缺失、易位和重排進(jìn)行診斷研究。

熒光原位雜交技術(shù)fish檢測(cè)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用在產(chǎn)前及植入前、腫瘤的預(yù)前和預(yù)后以及血液類疾病的診斷分型領(lǐng)域。