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ELISA的原理和操作步驟_91化工儀器網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-09-02  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):878
核心提示:ELISA原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),

ELISA原理

 

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

 

ELISA方法類型和操作步驟

elisa可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標(biāo)記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。  

雙位點(diǎn)一步法 

(一)雙抗體夾心法 

雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法,操作步驟如下: 

(1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。 

(2)加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間,讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。 

(3)加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。 

(4)加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。 

根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。 

 

(二)雙位點(diǎn)一步法 

在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí),如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作,縮短了反應(yīng)時(shí)間,如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體,測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。 

在一步法測(cè)定中,應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)(hookeffect),類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí),過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成夾心復(fù)合物,所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 

 

(三)間接法測(cè)抗體 

間接法是檢測(cè)抗體zui常用的方法,其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下: 

(1)將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。 

(2)加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,在洗滌過程中被洗去。 

(3)加酶標(biāo)抗抗體:與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合,從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體,可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。 

(4)加底物顯色:顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。 

本法只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。 

 

(四)競(jìng)爭(zhēng)法 

競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例,受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合,因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下: 

(1)將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。 

(2)待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原,則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原,則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì),使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原,保溫后,酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量。洗滌。 

(3)加底物顯色:參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多,故顏色zui深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差,代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡,表示標(biāo)本中抗原含量越多。 

 

(五)捕獲法測(cè)IgM抗體 

血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在,后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下: 

(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。 

(2)加入稀釋的血清標(biāo)本:保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。 

(3)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。 

(4)加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體:使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。 

(5)加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在,是為陽(yáng)性反應(yīng)。 

 

(六)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

 


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