手機(jī)版|
二維碼|
上傳人： 上海索寶生物科技有限公司 |大?。?6KB|瀏覽：4791次|下載：3次|上傳：2018-09-02
文檔簡(jiǎn)介 一原理Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無(wú)聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以BDFalcon細(xì)胞小室上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開(kāi)始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時(shí)后觀察結(jié)果較為合適。穿過(guò)濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用BDFalcon細(xì)胞小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在BDFalcon細(xì)胞小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在BDFalcon細(xì)胞小室中培養(yǎng)72小時(shí)后，有相當(dāng)數(shù)量穿過(guò)濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過(guò)重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)穿過(guò)濾膜，用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。二材料1.Matrigel基質(zhì)膠（BDBIOCOAT#356234），5ml，分裝成0.5ml/只10個(gè)EP管中；用時(shí)加入0.5ml的DMEM；Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時(shí)可迅速凝結(jié)成膠。使用前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過(guò)夜放置），避免反復(fù)凍融。使用時(shí)需接觸Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃；注意無(wú)菌操作；2.8ul，24孔配套細(xì)胞小室（BDFaclon#353097）；3.結(jié)晶紫染料溶液：結(jié)晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用濃度為0.1％，用PBS按1：4稀釋后即為染色液；4.33%醋酸；1.溶液配制：（1）.溶DMEM500ml；NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）母液0.1ml（5mg）+ddH2Oupto5ml；過(guò)濾消毒，-20℃保存。NE-DMEM（-6M）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlDMEMUPTO100ml過(guò)濾消毒，4℃保存（2）.NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlCGRP-儲(chǔ)存液50μlDMEMUPTO100ml過(guò)濾消毒，4℃保存（3）.NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlIFN-γ（25ng/μl）25μlDMEMUPTO100ml過(guò)濾消毒，4℃保存（4）.低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）（5）.20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）2.準(zhǔn)備（1）.溶膠，4℃過(guò)夜（ThawMatrigelat4℃overnight.）（2）.室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗(yàn)前-20C預(yù)冷。（Matrigeltendstoformgelveryquicklyatroomtemerature,therefore,pipetsandtipsusinginsteps2and3havetobechilledatpriortoexperiements.）3.包被基底膜（冰上操作）（1）.用無(wú)血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠（10mg/mlto5mg/ml））（DiluteMatrigel（10mg/mlto5mg/ml）inserumfree-coldcellculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEM,etc）.）（2）.取100ul稀釋膠加到24-well細(xì)胞小室的上室中（Put100ulofthedilutedmatrigelintoupperchamberof24-welltranswell）（3）.37℃孵育transwell至少4-5h（Incubatethetranswellat37Catleast4to5hforgelling.）4.水化基底膜用無(wú)血清培養(yǎng)基輕洗凝膠（Gentlywashgelledmatrigelwithwarmedserumfree-culturemedia.）5.準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室（1）.消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞；（HarvestcellsfromtissuecultureflasksbyTrypsin/EDTA；）（2）.用培養(yǎng)基洗3遍（Washthecells3timeswithculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEMetc）containing1%FBS.）（3）.重選細(xì)胞，5×105cells/ml，1%FBS（Resuspendthecellsinmediacontaining1%FBSatadensityof5×105cells/ml.）（4）.上室加200ul細(xì)胞懸液（Put200ulofthecellsuspensionontothematrigel.）（5）.下室中加入600ul細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5ug/mlfibronectin作為黏連亞族（lowerchamberofthetranswellisfilledwith600ulofculturemediacontaining,asanadhesivesubtrate.）6.孵育，37℃，20to24h（Incubateat37Cfor20to24h.7.染色和計(jì)數(shù)（1）.棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞（Scrapeoffnoninvadedcellsonthetopofthetranswellwithacottonswab）（2）.移去transwells，倒置，風(fēng)干（Removetranswellsfrom24-wellplatesandstainedwithDiff-Quicksolution.）（3）.24孔板中加入500l含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，37℃30min后取出，PBS清洗。（4）.直徑上取4個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)。（5）.24孔板中加入500l33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。小技巧：照相前一定要晾干，照相時(shí)將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、方便。
標(biāo)簽： 相關(guān)產(chǎn)品
文檔簡(jiǎn)介 一原理Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無(wú)聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。濾膜孔徑一般為8um，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內(nèi)情況較為相似。鋪有Martrigel的濾膜放在以BDFalcon細(xì)胞小室上下室之間，鋪有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趨化劑，如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，上室加入重懸的瘤細(xì)胞，具有侵襲能力的細(xì)胞在趨化劑誘導(dǎo)下開(kāi)始穿膜運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞穿膜所用的時(shí)間與Martrigel的用量有關(guān)，選擇25ugMartrigell鋪膜，16小時(shí)后觀察結(jié)果較為合適。穿過(guò)濾膜的細(xì)胞多數(shù)粘附在濾膜下表面，可用棉簽將上表面的細(xì)胞拭去，然后用乙醇固定濾膜，PE染色，在光鏡下觀察統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Martrigel的細(xì)胞數(shù)。另外用BDFalcon細(xì)胞小室也可進(jìn)行重建基質(zhì)膜侵襲分析，這一方法是在BDFalcon細(xì)胞小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel，加入細(xì)胞72h后觀察結(jié)果。值得注意的是，細(xì)胞在BDFalcon細(xì)胞小室中培養(yǎng)72小時(shí)后，有相當(dāng)數(shù)量穿過(guò)濾膜的細(xì)胞不再粘附在濾膜下表面，而是脫落進(jìn)人下腔溶液中．因此統(tǒng)計(jì)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)目時(shí)應(yīng)把這部分細(xì)胞考慮在內(nèi)。腫瘤細(xì)胞穿過(guò)重建基質(zhì)膜的能力與它的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，可以用重建基質(zhì)膜模型初篩抗侵襲藥物。在上述分析中，如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間，細(xì)胞通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)穿過(guò)濾膜，用這種模型對(duì)分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和藥物對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。另外，在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN，可分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化性或趨固性的影響。二材料1.Matrigel基質(zhì)膠（BDBIOCOAT#356234），5ml，分裝成0.5ml/只10個(gè)EP管中；用時(shí)加入0.5ml的DMEM；Matrivgel在冰上維持液態(tài)，室溫時(shí)可迅速凝結(jié)成膠。使用前應(yīng)從-20℃轉(zhuǎn)移至4℃待其自然溶化（如過(guò)夜放置），避免反復(fù)凍融。使用時(shí)需接觸Matrivgel的試管、移液吸頭等均應(yīng)預(yù)冷于4℃；注意無(wú)菌操作；2.8ul，24孔配套細(xì)胞小室（BDFaclon#353097）；3.結(jié)晶紫染料溶液：結(jié)晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用濃度為0.1％，用PBS按1：4稀釋后即為染色液；4.33%醋酸；1.溶液配制：（1）.溶DMEM500ml；NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）母液0.1ml（5mg）+ddH2Oupto5ml；過(guò)濾消毒，-20℃保存。NE-DMEM（-6M）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlDMEMUPTO100ml過(guò)濾消毒，4℃保存（2）.NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlCGRP-儲(chǔ)存液50μlDMEMUPTO100ml過(guò)濾消毒，4℃保存（3）.NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）20.5μlIFN-γ（25ng/μl）25μlDMEMUPTO100ml過(guò)濾消毒，4℃保存（4）.低血清DMEM培養(yǎng)基（上室）（5）.20%FBS-DMEM培養(yǎng)基（下室）2.準(zhǔn)備（1）.溶膠，4℃過(guò)夜（ThawMatrigelat4℃overnight.）（2）.室溫下基質(zhì)膠易成凝膠，所以，步驟2和3種使用試管和槍頭要在試驗(yàn)前-20C預(yù)冷。（Matrigeltendstoformgelveryquicklyatroomtemerature,therefore,pipetsandtipsusinginsteps2and3havetobechilledatpriortoexperiements.）3.包被基底膜（冰上操作）（1）.用無(wú)血清的冷細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM稀釋Matrigel膠（10mg/mlto5mg/ml））（DiluteMatrigel（10mg/mlto5mg/ml）inserumfree-coldcellculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEM,etc）.）（2）.取100ul稀釋膠加到24-well細(xì)胞小室的上室中（Put100ulofthedilutedmatrigelintoupperchamberof24-welltranswell）（3）.37℃孵育transwell至少4-5h（Incubatethetranswellat37Catleast4to5hforgelling.）4.水化基底膜用無(wú)血清培養(yǎng)基輕洗凝膠（Gentlywashgelledmatrigelwithwarmedserumfree-culturemedia.）5.準(zhǔn)備細(xì)胞懸液和小室（1）.消化法從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中獲取細(xì)胞；（HarvestcellsfromtissuecultureflasksbyTrypsin/EDTA；）（2）.用培養(yǎng)基洗3遍（Washthecells3timeswithculturemedia（RPMI1640,EMEM,DMEMetc）containing1%FBS.）（3）.重選細(xì)胞，5×105cells/ml，1%FBS（Resuspendthecellsinmediacontaining1%FBSatadensityof5×105cells/ml.）（4）.上室加200ul細(xì)胞懸液（Put200ulofthecellsuspensionontothematrigel.）（5）.下室中加入600ul細(xì)胞培養(yǎng)基，含有5ug/mlfibronectin作為黏連亞族（lowerchamberofthetranswellisfilledwith600ulofculturemediacontaining,asanadhesivesubtrate.）6.孵育，37℃，20to24h（Incubateat37Cfor20to24h.7.染色和計(jì)數(shù)（1）.棉簽擦去上室上面的非侵襲細(xì)胞（Scrapeoffnoninvadedcellsonthetopofthetranswellwithacottonswab）（2）.移去transwells，倒置，風(fēng)干（Removetranswellsfrom24-wellplatesandstainedwithDiff-Quicksolution.）（3）.24孔板中加入500l含0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，37℃30min后取出，PBS清洗。（4）.直徑上取4個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)。（5）.24孔板中加入500l33%醋酸，將小室置于其中，浸膜，振蕩10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)OD值，間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)。小技巧：照相前一定要晾干，照相時(shí)將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察、照相。經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、方便。
標(biāo)簽： 相關(guān)產(chǎn)品
