梯度洗脫是在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，就是梯度洗脫，也被叫做梯度淋洗或程序洗脫。在氣相色譜中，為了改善對寬沸程樣品的分離和縮短分析周期，廣泛采用程序升溫的方法。而在液相色譜中對組分復雜的樣品則采用梯度洗脫的方法。在同一個分析周期中，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個復雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。

簡單來說，梯度洗脫原理是流動相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時間內(nèi)實現(xiàn)最佳分離。

梯度洗脫原理具體地講就是，當樣品隨梯度起點的流動相進入色譜柱入口時，由于起點流動相中強洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較強)因分配系數(shù)(k值)較高而滯留于色譜柱入口附近，幾乎未移動。一段時間后，B增加到一定數(shù)值，C1的k值達到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動速率愈加快速，直到tC1時流出色譜柱，被檢測器檢測到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時的保留時間長很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續(xù)增加，在隨后的某個時間點，C2的k值也降到10以下，C2的移動速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。

在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：

①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。

③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡。

梯度洗脫可分為低壓梯度(又稱為外梯度)和高壓梯度(又稱為內(nèi)梯度)。

(1)低壓梯度裝置。低壓梯度是采用比例調(diào)節(jié)閥，在常壓下預先按一定的程序?qū)⑷軇┗?/p>

合后，再用泵輸入色譜柱系統(tǒng)，也稱為泵前混合。

(2)高壓梯度裝置。由兩臺(或多臺)高壓輸液泵、梯度程序控制器(或計算機及接口板控

制)、混合器等部件所組成。兩臺(或多臺)泵分別將兩種(或多種)極性不同的溶劑輸入混合

器，經(jīng)充分混合后進入色譜柱系統(tǒng)。

提高柱效，改善檢測器的靈敏度。當樣品中的一個峰的k值和最后一個峰的k值相差幾十倍至幾百倍時，使用梯度洗脫效果特別好。梯度洗脫中為保證流速的穩(wěn)定，必須使用恒流泵，否則難獲重復結(jié)果。梯度洗脫常用一個弱極性的溶劑A和一個強極性的溶劑B。

兩個容器放于同一水平上，兩容器連通，B與柱相連，當溶液由B流入柱時，A中的溶液就會自動來補充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。

梯度洗脫時，將在分離過程中按照一定的程序，連續(xù)改變兩種（或多種）極性不同的流動相的濃度配比和極性，并通過流動相極性的變化進而改變被分離樣品的選擇因子值和保留時間，以使色譜柱具有更好的選擇性和更大的峰容量。采用梯度洗脫技術(shù)可以提高分離度、縮短分析時間、提高靈敏度。此方式適于分離復雜混合物，特別是保留性能相差較大的混合物。

當使用反相色譜時，逐步提高有機相含量，額可以使得在色譜柱上強保留物質(zhì)更快速洗脫下來，節(jié)約分析時間，

梯度洗脫：在同一個分析周期中，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比

等度洗脫則是指從頭到尾只是用同一個流動相。

用不用梯度洗脫，主要看雜質(zhì)的情況。同一物質(zhì)有梯度和等度兩種條件時，梯度的認可度較高。雜質(zhì)與雜質(zhì)、主峰、溶劑峰的分離度一定要好（不好的話就要用梯度）。

（1）雜質(zhì)和主成分極性相差很大，雜質(zhì)一定要全部都能洗脫出來（有時等度情況下從兩三個小時雜質(zhì)也沖出不來，就必須考慮等度）。

（2）雜質(zhì)和主成分極性相差較大，雜質(zhì)出峰太晚（等度沖兩個小時出來個雜質(zhì)，就可以通過梯度縮短檢樣時間）

（3）還有就是雜質(zhì)極性比主峰的大，等度時要想主峰時間合適雜質(zhì)全堆在前邊，雜質(zhì)分開主峰又出峰太晚，這種情況也得考慮梯度洗脫。

在能達到較好的分離度的情況下能用等度就用等度，畢竟用梯度要麻煩一些。