PCR技術(shù)是指,在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點(diǎn),通過(guò)變性、退火、延伸等步驟,體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。
總體積:一般為25μl~100 μl
(一)Mg2+:終濃度為1。5~2。0mmol/L,其對(duì)應(yīng)dNTP為200 μmol/L,注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系,由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+,當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。 Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。
(二)無(wú)Mg2+buffer:由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值,使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度,但不能超過(guò)50 mmol/L,否則會(huì)抑制DNA聚合酶活性。
(三)BSA:一般用乙?;腂SA,起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用,對(duì)Taq酶有保護(hù)作用。
(四)底物(dNTPs):dNTPs具有較強(qiáng)酸性,其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7。0~7。5,一般存儲(chǔ)濃度為 10 mmol/L,各成份以等當(dāng)量配制,反應(yīng)終濃度為20~200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng),但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本;低濃度可提高精確性,而反應(yīng)速度會(huì)降低。
(五)Taq酶:能耐95℃高溫而不失活,其最適pH值為8。3~8。5,最適溫度為75~80℃,一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板,以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ),按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端,合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)3’→5’的外切酶活性,沒(méi)有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過(guò)高,會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0。5~5個(gè)單位/100μl。
(六)模板:PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高,但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高,否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功,在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。
(七)引物:引物濃度一般為0。1~0。5μmol/L,濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增,濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般15~30個(gè)堿基,引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對(duì),末位堿基最好選用A、C、G(因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸)。
引物G+C約占45~55%,堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布,避免嘧啶或嘌呤堆積,兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在,不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。
a、變性:模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵,一般先于94℃(或95℃)變性3~10min,接著94℃變性30~60s。
b、退火:退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長(zhǎng)度在15~25bp可通過(guò)公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃計(jì)算退火溫度,一般退火溫度在40~60℃之間,時(shí)間為30~45s。如果(G+C)低于50%,退火溫度應(yīng)低于55℃。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。
c、延伸:延伸溫度應(yīng)在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi),一般在70~75℃。延伸時(shí)間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定,通常對(duì)于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。
以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板,經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后,目的DNA以2n的形式增加。
循環(huán)數(shù):
PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定,一般20~30次循環(huán)數(shù)較合適,過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物,具體要多少循環(huán)數(shù)可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定。
PCR產(chǎn)物積累規(guī)律:
反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加,至一定的循環(huán)數(shù)后,引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡,產(chǎn)物進(jìn)入一個(gè)緩慢增長(zhǎng)時(shí)期(“停滯效應(yīng)”),即“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴(kuò)增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟?fàn)幱嘘P(guān)。
如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。
2、假陽(yáng)性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有
①模板核酸的制備,
②引物的質(zhì)量與特異性,
③酶的質(zhì)量及,
④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
不對(duì)稱PCR主要是在PCR體系中設(shè)計(jì)不同的引物濃度,兩條引物濃度比為1:50或1:100,前12個(gè)循環(huán)兩條模板等量擴(kuò)增,之后低濃度引物消耗殆盡,其擴(kuò)增產(chǎn)物減少以至于無(wú);而高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物(即單鏈DNA)逐漸增加,可得到大量單鏈DNA(ssDNA)用于直接測(cè)序。
多重PCR應(yīng)用于基因診斷,對(duì)與疾病相關(guān)的基因(龐大)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。是用多對(duì)引物同時(shí)對(duì)模板DNA上的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。
多重PCR技術(shù)的難點(diǎn)不是在于其原理和操作的復(fù)雜性,而是在于其多對(duì)引物的設(shè)計(jì),必需保證多對(duì)引物之間不形成引物二聚體,引物與目標(biāo)模板區(qū)域具有高度特異性。
由mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反應(yīng)模板。
逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí),引物可選用特異引物、隨機(jī)六聚體引物或寡聚dT(12-18)。
設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)最好是分散在不同的外顯子上,以免基因組DNA的污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果
引進(jìn)錨定引物,可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。
在DNA3’-末端加上poly(dG)尾,與此相對(duì)應(yīng)的錨定引物poly(dC)一般應(yīng)在十二聚以上。