pcrpcr儀

PCR技術(shù)是指，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。

一、PCR技術(shù)的基本原理和操作

1、PCR反應(yīng)的成分和作用 

總體積：一般為25μl～100 μl

（一）Mg2+:終濃度為1。5～2。0mmol/L，其對(duì)應(yīng)dNTP為200 μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。 Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。

（二）無(wú)Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過(guò)50 mmol/L，否則會(huì)抑制DNA聚合酶活性。

（三）BSA：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用，對(duì)Taq酶有保護(hù)作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7。0～7。5，一般存儲(chǔ)濃度為 10 mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8。3～8。5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)3’→5’的外切酶活性，沒(méi)有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過(guò)高,會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0。5～5個(gè)單位/100μl。

（六）模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。

（七）引物：引物濃度一般為0。1～0。5μmol/L，濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般15～30個(gè)堿基，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物G+C約占45～55%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。

2、PCR反應(yīng)步驟和反應(yīng)條件選擇（影響因素）

a、變性：模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。

b、退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長(zhǎng)度在15～25bp可通過(guò)公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃計(jì)算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時(shí)間為30～45s。如果(G+C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55℃。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。

c、延伸：延伸溫度應(yīng)在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。延伸時(shí)間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定，通常對(duì)于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。

以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。

循環(huán)數(shù)：

PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環(huán)數(shù)較合適，過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定。

PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：

反應(yīng)初期產(chǎn)物以2n呈指數(shù)形式增加，至一定的循環(huán)數(shù)后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產(chǎn)物進(jìn)入一個(gè)緩慢增長(zhǎng)時(shí)期（“停滯效應(yīng)”），即“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)數(shù)與模板量、PCR擴(kuò)增效率、聚合酶種類、非特異產(chǎn)物竟?fàn)幱嘘P(guān)。

二、PCR常見(jiàn)問(wèn)題

1、靶序列變異

如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

 

2、假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

3、假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的處理

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有

①模板核酸的制備，

②引物的質(zhì)量與特異性，

③酶的質(zhì)量及，

④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

4、引物設(shè)計(jì)不合適

選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

5、酶失活

需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

三、其它PCR技術(shù)介紹

1、不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR)

不對(duì)稱PCR主要是在PCR體系中設(shè)計(jì)不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個(gè)循環(huán)兩條模板等量擴(kuò)增，之后低濃度引物消耗殆盡，其擴(kuò)增產(chǎn)物減少以至于無(wú)；而高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測(cè)序。

2、多重PCR(multiplex PCR)

多重PCR應(yīng)用于基因診斷，對(duì)與疾病相關(guān)的基因（龐大）進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。是用多對(duì)引物同時(shí)對(duì)模板DNA上的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。

多重PCR技術(shù)的難點(diǎn)不是在于其原理和操作的復(fù)雜性，而是在于其多對(duì)引物的設(shè)計(jì)，必需保證多對(duì)引物之間不形成引物二聚體，引物與目標(biāo)模板區(qū)域具有高度特異性。

3、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

由mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反應(yīng)模板。

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)，引物可選用特異引物、隨機(jī)六聚體引物或寡聚dT(12-18)。

設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)最好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果

4、錨定PCR(anchored PCR)：

引進(jìn)錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。

在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對(duì)應(yīng)的錨定引物poly(dC)一般應(yīng)在十二聚以上。

2018-06-15 16:18:05 22494 http://www.yiqi.com/citiao/detail_755.html 熱門標(biāo)簽： 熒光定量pcr