分子雜交指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈(DNA分子或RNA)，在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為分子探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

一、DNA分子變性

DNA分子變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團，因而發(fā)生性質(zhì)改變(如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等)。

1、DNA分子變性的方法：①加熱;②改變DNA分子溶液的pH;③有機溶劑(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。

2、增色效應(yīng)：DNA分子在260nm處有最大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。利用DNA分子變性后波長260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過程。

3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA分子變性，以溫度對紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。

4、融解溫度：通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度(即熔解曲線中點對應(yīng)的溫度)，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，故又稱融點或融解溫度。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半時的溫度。

5、影響Tm值的因素：Tm不是一個固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：

①外部因素：pH、離子強度。隨著溶劑內(nèi)離子強度上升，Tm值也隨著增大。

②內(nèi)部因素：DNA分子的堿基比例、DNA分子的均一性;在相同條件下，DNA分子內(nèi)G-C配對含量高，其Tm值也高。

二、DNA分子復(fù)性

變性DNA分子只要消除變性條件，二條互補鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。

退火：通常DNA分子熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25～30℃左右時，變性后的單鏈DNA分子即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，這一過程又叫做退火。

復(fù)性后的DNA分子，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。倘若DNA分子熱變后快速冷卻，則不能復(fù)性。

影響復(fù)性速度的因素：

1、DNA分子濃度：愈高，復(fù)性速度也愈快。

2、DNA分子片段的大?。篋NA分子片段愈大，擴散速度愈低，使DNA分子片段線狀單鏈互相發(fā)現(xiàn)互補的機會減少。因此，在復(fù)性實驗中，有時將DNA分子切成小片段，再進行復(fù)性。

3、溫度：過高不利于復(fù)性。

4、溶液的離子強度：通常鹽濃度較高時，復(fù)性速度較快。

5、DNA分子順序的復(fù)雜性;簡單的分子復(fù)性很快，如polyd和polyd由于彼此互補識別很快，故能迅速復(fù)性。但順序較復(fù)雜的DNA分子復(fù)性則較慢。因此通過變性速率的研究，可以了解DNA分子順序的復(fù)雜性。

放射性同位素、生物素或熒光染料進行標(biāo)記的已知序列的核酸片段，即為分子探針。分子探針可用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。

分子探針根據(jù)標(biāo)記物不同可粗分為放射性分子探針和非放射性分子探針兩大類;根據(jù)分子探針的來源及核酸性質(zhì)不同又可分為DNA分子探針，RNA分子探針，cDNA分子探針，及寡核苷酸分子探針等幾類。

1、DNA分子探針：

DNA分子探針是最常用的核酸分子探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA分子或單鏈DNA分子探針。現(xiàn)已獲得DNA分子探針數(shù)量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA分子探針。這類分子探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。

DNA分子探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細菌的分類和菌種鑒定比之GC百分比值要準(zhǔn)確的多，是細菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。

DNA分子探針(包括cDNA分子探針)的優(yōu)點：

①這類分子探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。

②不易降解(相對RNA而言)，一般能有效抑制DNA分子酶活性。

③DNA分子探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。

2、cDNA分子探針：

cDNA分子(complementaryDNA分子)分子探針是指互補于mRNA的DNA分子，是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA分子(其中U與A配對)。cDNA分子探針是目前應(yīng)用最為廣泛的一種分子探針。

3、RNA分子探針：

RNA分子探針是一類很有前途的核酸分子探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA分子探針是細胞mRNA分子探針和病毒RNA分子探針，這些RNA是在細胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA分子探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。

4、克隆分子探針：

前述三種分子探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的分子探針，就不用寡核苷酸分子探針。在DNA分子序列未知而必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應(yīng)用克隆。

分子雜交可按作用環(huán)境大致分為液相雜交和固相雜交兩種類型。

液相雜交：液相雜交指所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相雜交是一種研究最早且操作復(fù)合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交分子探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。

固相雜交：固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條核酸鏈游離在溶液中。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA分子自我復(fù)性等優(yōu)點，故該法最為常用。根據(jù)支持物的不同固相雜交又可為：濾膜雜交、菌落分子原位雜交和組織分子原位雜交。

1、原理：

分子原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的分子原位雜交，它與菌落的分子原位雜交不同。菌落分子原位雜交需裂解細菌釋出DNA分子，然后進行雜交。

而分子原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細胞通透性增加，讓分子探針進入細胞內(nèi)與DNA分子或RNA雜交。因此分子原位雜交可以確定分子探針的互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。

2、應(yīng)用：

①對致密染色體DNA分子的分子原位雜交可用于顯示特定的序列的位置;

②對分裂期間核DNA分子的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布;

③與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布;

④分子原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。

3、分子探針選擇：

用于分子原位雜交的分子探針可以是單鏈或雙鏈DNA分子，也可以是RNA分子探針。通常分子探針的長度以100～400bp為宜，過長則雜交效率減低。

最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸分子探針(16～30bp)能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長分子探針。因此，寡核苷酸分子探針和不對稱PCR標(biāo)記的小DNA分子探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA分子探針是組織分子原位雜交的優(yōu)選分子探針。

4、分子探針的標(biāo)記：

分子探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。

放射性同位素中，3H和35S最為常用。

3H標(biāo)記的分子探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點是能量低。

35S標(biāo)記分子探針活性較高，影像分辨率也較好。

32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。

5、組織與細胞的固定：

分子原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對分子探針進入細胞極為重要。

去除蛋白的方法是，用0.2mol/LHCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，分子原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進一步完善和提高。

1、分子探針的選擇

根據(jù)不同的雜交實驗要求，應(yīng)選擇不同的核酸分子探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA分子或cDNA分子雙鏈分子探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的分子探針如寡核苷酸分子探針和RNA分子探針。

①檢測靶序列上的單個堿基改變時應(yīng)選用寡核苷酸分子探針;

②在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補的DNA分子單鏈分子探針(通過克隆人M13噬菌體DNA分子獲得)或RNA分子探針，寡核苷酸分子探針也可;

③檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體應(yīng)選用特異性較強的長的雙鏈DNA分子探針;

④組織分子原位雜交應(yīng)選用寡核苷酸分子探針和短的PCR標(biāo)記分子探針(80～150bp)，因為它易透過細胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)。

2、分子探針的標(biāo)記方法

在選擇分子探針類型的同時，還需要選擇標(biāo)記方法。分子探針的標(biāo)記方法很多，選擇什么標(biāo)記方法主要視個人的習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標(biāo)記方法時，還應(yīng)考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性分子探針比非放射性分子探針的靈敏度高。

放射性分子探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標(biāo)記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測單拷貝基因序列時，應(yīng)選用標(biāo)記效率高、顯示靈敏的分子探針標(biāo)記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素分子探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。

3、分子探針的濃度

隨分子探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄的范圍內(nèi)，隨分子探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記分子探針與非放射性標(biāo)記分子探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而分子原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記分子探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。分子探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。

4、雜交率

傳統(tǒng)雜交率分析主要用于DNA分子復(fù)性研究，在這種情況下，分子探針和靶鏈在溶液中的濃度相同?，F(xiàn)代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在分子探針過剩的條件下進行，此外，固相雜交中靶序列不在液相，故其濃度不能精確計算。

5、雜交最適溫度

雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm的10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低(Tm-30℃)，雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA分子，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。

6、雜交的嚴格性

影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式計算雜交體Tm值。通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。

7、雜交反應(yīng)時間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成;時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行20h左右。

8、雜交促進劑

雜交促進劑可用來促進250個堿基以上的分子探針的雜交率。對單鏈分子探針可增加3倍，而對雙鏈分子探針、隨機剪切或隨機引物標(biāo)記的分子探針可增加高達100倍。而短分子探針不需用促進劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短分子探針本身的雜交率就高。