蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

蛋白質(zhì)印跡優(yōu)點(diǎn)、原理和步驟

免疫印跡（immunoblotting）又叫做蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是通過抗原抗體的特異性結(jié)合來對復(fù)雜樣品中的某種蛋白進(jìn)行檢測的方法。...[查看全部]

免疫印跡法實(shí)驗(yàn)原理和目的 ： 免疫印跡法臨床應(yīng)用免疫印跡主要試劑免疫印跡分類和原理免疫印跡法操作步驟免疫印跡法原理、試劑準(zhǔn)備和注意事項(xiàng)

免疫印跡（immunoblotting）又叫做蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是通過抗原抗體的特異性結(jié)合來對復(fù)雜樣品中的某種蛋白進(jìn)行檢測的方法。此方法是一種新的免疫生化技術(shù)。

免疫印跡法 (Western blotting) 是一種結(jié)合了免疫化學(xué)分析和技術(shù)高分辨率凝膠電泳的雜交技術(shù)。免疫印跡法是對蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布進(jìn)行檢測最常用的一種方法，例如病毒的抗體或抗原檢測、多肽分子的質(zhì)量測定與組織抗原的定性定量檢測。免疫印跡法具有很強(qiáng)的特異性，很高的敏感度以及很大的分析容量。免疫印跡法(immunoblotting test,IBT)也叫做酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),由于其類似于Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法 Southern blot ，因此也被叫做Western-blot。

電轉(zhuǎn)移方法

一般需要利用電泳方法將經(jīng)電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體上，這個(gè)過程被叫做電泳印跡。以下為常用的兩種電轉(zhuǎn)移方法。

1.半干法:

用緩沖溶液浸濕的濾紙將凝膠和固相載體夾在中間，通電10-30min。

2.濕法：

在轉(zhuǎn)移緩沖溶液中浸放凝膠和固相載體夾心，由45min延長到過夜為轉(zhuǎn)移時(shí)間。

因?yàn)闈穹ㄓ懈蟮氖褂脧椥远覜]有對更多的時(shí)間和原料產(chǎn)生明顯地浪費(fèi)，所以這里僅對濕法的基本操作過程進(jìn)行描述。

需要采用可以識(shí)別一抗的第二抗體來識(shí)別目的蛋白，往往將購買的成品，即是如辣根過氧化物酶般已經(jīng)被結(jié)合或標(biāo)記了特定的試劑作為抗體。利用辣根過氧化物酶所催化的一個(gè)比色反應(yīng)，即是這種標(biāo)記，該反應(yīng)的產(chǎn)物在固相載體上固定以及有特定的顏色，鑒別非常容易。所以能夠根據(jù)識(shí)別二抗來對一抗進(jìn)行識(shí)別，從而使目標(biāo)蛋白所在的位置被判斷出來。堿性磷酸酶系統(tǒng)和125I標(biāo)記系統(tǒng)均屬于其他的識(shí)別系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)印跡法又叫做免疫印跡法，這是一種

... 查看全文
免疫印跡法操作步驟 ： 免疫印跡法臨床應(yīng)用免疫印跡主要試劑免疫印跡分類和原理免疫印跡法實(shí)驗(yàn)原理和目的免疫印跡法原理、試劑準(zhǔn)備和注意事項(xiàng)

免疫印跡法就是將蛋白質(zhì)往膜上轉(zhuǎn)移，之后利用抗體進(jìn)行檢測。能夠使用相應(yīng)抗體作為一抗對已知表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，能夠通過融合部分的抗體對新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

操作步驟

一、獲取蛋白質(zhì)樣品：

細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，能夠通過電泳上樣緩沖液將細(xì)胞直接裂解，將勻漿緩沖液加在真核細(xì)胞上，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1分鐘。之后4攝氏度下13,000g離心15分鐘，取上清液作為樣品。

二、電泳：

對電泳凝膠進(jìn)行制備，進(jìn)行SDS-PAGE。

三轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）

1、完成電泳后將膠條切成合適大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，分別進(jìn)行3次，每次5分鐘。

2、膜處理：將與膠條同樣大小的濾紙和NC膜預(yù)先裁好，將其在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸沒10分鐘。

3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置按照從下至上的順序依次將陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板放好，精確對齊濾紙、凝膠、NC膜，每一步均將氣泡去除，將500g重物壓上，吸干碳板上多余的液體。將電源接通，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。完成轉(zhuǎn)移后，將電源斷開，取出膜，對待測膜條割取來做免疫印跡。在膜染色液中放入有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色50秒之后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干，保存在兩層濾紙之間，和顯色結(jié)果對比。

四免疫反應(yīng)：

1、洗膜使用0.01M PBS進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共3次。

2.將包被液加入加入，室溫下保持2小時(shí)。

3.將包被液棄掉，洗膜使用0.01M PBS進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共3次。

4.將一抗加入（用0.01M PBS根據(jù)合適稀釋比例進(jìn)行稀釋，膜必須全部為液體所覆蓋），在4攝氏度下放置超過12小時(shí)，陰性對照，一抗使用1%BSA替代，其余步驟和實(shí)驗(yàn)組一樣。

5.將1%BSA和一抗棄掉。膜使用0.01M PBS分別進(jìn)行清洗，每次5分鐘，一共4次。

6、將辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗加入（用0.01M PBS根據(jù)合適稀釋比例進(jìn)行稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫下保持兩

... 查看全文
蛋白質(zhì)印跡優(yōu)點(diǎn)、原理和步驟 ： 免疫印跡法臨床應(yīng)用免疫印跡主要試劑免疫印跡分類和原理免疫印跡法實(shí)驗(yàn)原理和目的免疫印跡法操作步驟

免疫印跡（immunoblotting）又叫做蛋白質(zhì)印跡（Western blotting），是通過抗原抗體的特異性結(jié)合來對復(fù)雜樣品中的某種蛋白進(jìn)行檢測的方法。此方法是一種新的免疫生化技術(shù)，其是基于凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)發(fā)展出來的。如今免疫印跡已經(jīng)成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，因?yàn)槠浼染邆涔滔嗝庖邷y定的高特異性和敏感性，又具備SDS-PAGE 的高分辨力。某種蛋白的鑒定一般使用免疫印跡，并且可以定性和半定量分析蛋白。和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合進(jìn)行檢測，能夠同時(shí)對多個(gè)樣品同種蛋白的表達(dá)量差異進(jìn)行比較。

優(yōu)點(diǎn)

免疫印跡法是一項(xiàng)對抗原、抗體進(jìn)行分析的技術(shù)。其具備如下優(yōu)點(diǎn)。

1.孵育、洗滌的時(shí)間減短非常明顯。

2.為了用于多種分析和鑒定，能夠同時(shí)制作多個(gè)拷貝。

3.以圖譜形式顯示結(jié)果，能夠長期保存結(jié)果。

4.免疫探針能夠利用將PH值降低等方法抹掉探針，用第二探針替換來進(jìn)行進(jìn)行分析檢測。

5.濕的固定化基質(zhì)膜柔韌，操作簡單便捷。

6.固定化的生物大分子能夠均一地接近各種免疫探針，孔徑不會(huì)對其起阻隔作用。

7.免疫印跡分析所需的試劑量較少。

基本原理

在凝膠板上單向或雙向電泳分離混合抗原樣品，之后取固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。凝膠中的單一抗原組在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下往印跡紙上轉(zhuǎn)移并且固相化，最后應(yīng)用如免疫同位素探針或免疫酶探針等免疫覆蓋液技術(shù)檢測和分析抗原固定化基質(zhì)膜。

基本步驟

抗原分離、抗原印跡和抗原檢定為免疫印跡法（ 以抗原分析為例）的三個(gè)基本步驟。因?yàn)槊恳徊讲捎貌煌膶?shí)驗(yàn)方法，能夠使多種免疫印跡分析系統(tǒng)構(gòu)成。

... 查看全文
免疫印跡法臨床應(yīng)用 ： 蛋白質(zhì)印跡優(yōu)點(diǎn)、原理和步驟免疫印跡法三個(gè)階段免疫印跡法原理、試劑準(zhǔn)備和注意事項(xiàng)免疫印跡法操作步驟免疫印跡法實(shí)驗(yàn)原理和目的

免疫印跡法是往膜上轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，然后利用抗體進(jìn)行檢測?？赏ㄟ^融合部分的抗體對新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可用相應(yīng)抗體作為一抗對已知表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測。其有很強(qiáng)的特異性，很高的敏感度，以及很大的分析容量。在對于蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的檢測方面最為常用。例如病毒的抗體或抗原檢測、多肽分子的質(zhì)量測定以及組織抗原的定性定量檢測。

相關(guān)疾病

巨細(xì)胞病毒感染癥

免疫反應(yīng)

進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良癥

胃潰瘍

泌尿生殖系真菌病

格斯特曼綜合征

小兒喘息樣支氣管炎

小兒幽門螺桿菌感染

肺出血－腎炎綜合征

丁型病毒性肝炎

相關(guān)癥狀

腸粘膜有壞死潰瘍

潰瘍

幽門前區(qū)潰瘍

臨床意義

需要檢查人群：檢查某種蛋白。異常結(jié)果：有特殊顯色反應(yīng)，證明有某種蛋白質(zhì)存在。

注意事項(xiàng)

不適宜人群：無

檢查時(shí)禁忌：無

1、不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度的最佳條件。

2、使用時(shí)必須新鮮配置顯色液，最后將H2O2加入。

3、DAB有潛在可能致癌，要小心仔細(xì)地操作。

... 查看全文
免疫印跡法原理、試劑準(zhǔn)備和注意事項(xiàng) ： 免疫印跡法臨床應(yīng)用免疫印跡主要試劑免疫印跡分類和原理免疫印跡法實(shí)驗(yàn)原理和目的免疫印跡法操作步驟

免疫印跡法就是將蛋白質(zhì)往膜上轉(zhuǎn)移，之后利用抗體進(jìn)行檢測。能夠使用相應(yīng)抗體作為一抗對已知表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測，能夠通過融合部分的抗體對新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

原理

Western Blot類似于Southern或Northern雜交方法，然而其采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，用標(biāo)記的二抗來“顯色”，抗體為“探針”，蛋白質(zhì)為被檢測物。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品往固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上轉(zhuǎn)移，固相載體以非共價(jià)鍵形式來進(jìn)行蛋白質(zhì)的吸附，并且可以使其生物學(xué)活性和電泳分離的多肽類型保持不變。抗原使用固相載體上的蛋白質(zhì)或多，和對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過放射自顯影或者底物顯色來對電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分進(jìn)行檢測。該技術(shù)也在蛋白水平的表達(dá)的檢測方面得到廣泛地應(yīng)用。

試劑準(zhǔn)備

1、0.01M PBS(pH7.4）：

Na2HPO4 1.44g；

KH2PO4 0.24g；

NaCl 8.0g；

KCl 0.2g；

加ddH2O至1000ml。

2、膜染色液：

乙酸2ml；

ddH2O118 ml；

包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

考馬斯亮蘭 0.2g；

甲醇80ml。

3、顯色液：

硫酸鎳胺 0.1ml；

H202 1.0μl；

DAB 6.0mg；

0.01M PBS 10.0ml。

4、SDS-PAGE試劑：見電泳實(shí)驗(yàn)。

5、勻漿緩沖液：

10%SDS 6.0ml；

1.0M Tris-HCl(pH 6.8)；

1.OmlddH2O 2.8ml；

β-巰基乙醇 0.2ml。

6、轉(zhuǎn)膜緩沖液：

SDS 0.37g；

甲醇200ml；

甘氨酸 2.9g；

Tris 5.8g；

加ddH2O定容至1000ml。

注意事項(xiàng)

1、DAB有潛在可能致癌，要小心仔細(xì)地操作。

2、使用時(shí)必須新鮮配置顯色液，最后將H2O2加入。

3、不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定一抗、二

... 查看全文
免疫印跡主要試劑 ： 免疫印跡法臨床應(yīng)用免疫印跡分類和原理免疫印跡法實(shí)驗(yàn)原理和目的免疫印跡法操作步驟免疫印跡法原理、試劑準(zhǔn)備和注意事項(xiàng)

Western免疫印跡（WesternBlot）是往膜上轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，然后利用抗體進(jìn)行檢測?？赏ㄟ^融合部分的抗體對新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測?？捎孟鄳?yīng)抗體作為一抗對已知表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測。

主要試劑

1、5%(w/v)脫脂奶粉。

2、在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中溶解NaN30.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)。

3、Tris緩沖鹽溶液(TBS):

NaCl 500mmol/L，Tris/HCL(pH7.5)20mmol/L。

4、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

5、過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。

6、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

7、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

8、Tris-HCL(pH9.5)100mmol/L。

9、NaCl100mmol/L。

10、EDTA5mmol/L，Tris-HCL(pH7.5)50mmol/L。

11、丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺：

含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液的配制應(yīng)當(dāng)使用溫?zé)幔▽θ芙怆p丙稀酰胺有利）的去離子水。取1gN，N-亞甲叉雙丙稀酰胺，29g丙稀酰胺，將水加入到100毫升。將其在棕色瓶中，4℃避光保存。由于堿催化或者光催化會(huì)發(fā)生脫氨基反應(yīng)，因此必須確保PH不高于7.0。如果出現(xiàn)沉淀，可以過濾，若使用期超過兩個(gè)月，就必須重新配制。

12.十二烷基硫酸鈉SDS溶液:

10%(w/v)0.1gSDS使用1mlH2O去離子水配制，在室溫下保存。

13、分離膠緩沖液:

48ml 1mol/LHCL和1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8): 18.15g Tris混合，加水稀釋，使終體積到100ml，過濾后在40攝氏度下保存。

14、濃縮膠緩沖液:

在40ml H2O中溶解0.5mmol/L Tris-HCL(pH6.8):6.05g Tri

... 查看全文