不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病造模大鼠的血清IL-6.β2-MG及腎臟TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 點(diǎn)擊次數(shù)：8 發(fā)布日期：2019-8-20 來源：本站 僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
 摘要目的
探究不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù)在糖尿病造模過程對(duì)血清白細(xì)胞介素6( interleukin6,I-6)、 2微球蛋白(B2 microglobulin,2MG)和腎臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子l( transforming growth factor-1,TGF-B1)的影響。方法選取50只SD雄性大鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組5組,每組10只正常對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng),糖尿病對(duì)照組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、髙強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組髙糖高脂喂養(yǎng),糖尿病對(duì)照組籠中自由活動(dòng),低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組實(shí)驗(yàn)期間分別進(jìn)行不同負(fù)荷的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。腎臟組織以過碘酸六胺銀( periodic acidsilver methenamine,PASM)染色。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定( enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)大鼠血清中I6、全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清B2MG的濃度。 Western blot檢測(cè)大鼠腎臟組織TGFB1蛋白表達(dá)。結(jié)果PASM染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)清晰,基底膜無明顯改變;糖尿病對(duì)照組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組腎小球基底膜有所增厚,系膜區(qū)眀顯増寬;中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組腎小球基底無明顯増厚,系膜區(qū)輕微增寬。 ELISA結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組相比,低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組血淸I-6水平均明顯下降(P 0.05)。各組大鼠之間血清B2MG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。 Western blot結(jié)果表明各組間TGF-B1的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。結(jié)論在糖尿病造模過程中,8周耐力運(yùn)動(dòng)可通過降低機(jī)體血清I-6水平并保護(hù)腎臟組織結(jié)構(gòu),且中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)保護(hù)作用最為顯著。
 
關(guān)鍵詞2型糖尿病;耐力運(yùn)動(dòng);腎臟損傷  
糖尿病是以血糖升高為主要表現(xiàn)的慢性代謝性疾病之一,主要是由于胰島素完全缺乏或相對(duì)缺乏所致。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球有超過3.46億人患有糖尿病 在沒有任何干預(yù)的情況下,到2030年這一數(shù)據(jù)可能會(huì)增加一倍以上。腎損傷、氧化應(yīng)激、低度炎癥是2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)診斷前通常遇到的主要并發(fā)癥2。白細(xì)胞介素6( interleukin6,Il-6)被認(rèn)為是促炎細(xì)胞因子和T2DM的預(yù)測(cè)因子,是導(dǎo)致胰島素抵抗和血糖穩(wěn)態(tài)惡化重要因子;并且IL-6濃度對(duì)腎小球早期損害較其他指標(biāo)更敏感L血清中 2-微球蛋白( 2 microglobulin, 2MG)水平可以反映出機(jī)體腎小管功能早期損害,是糖尿病腎病早期診斷指標(biāo)之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B1( transforming growth factor-B1,TGF-B1)家族中最重要的因子,可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)( extracellular matrix,ECM)的增多,導(dǎo)致腎組織纖維化,促使腎臟疾病的進(jìn)一步發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高糖高脂膳食聯(lián)合注射鏈脲佐菌素( streptozotocin,STZ)建立T2DM大鼠模型,并在模型建立過程中施加不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)干預(yù),探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠造模過程中血清IL6、 2-MG及腎臟TGF-B1的影響,研究運(yùn)動(dòng)防治糖尿病的機(jī)制
 
1資料與方法
 
1.1試劑與儀器
 
STZ(批號(hào):WXBC6558V,美國 sIgma生物技術(shù)公司);大鼠l-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(批號(hào):13316123115,武漢博士德,中國)、B2-MG檢測(cè)試劑盒
(批號(hào):Y70110,伊利康生物技術(shù)有限公司);TGFB1兔抗大鼠一抗(批號(hào):21898,武漢 Proteintech公司,中國)、羊抗兔IgG(批號(hào):LK2001,天津三箭,中國)大鼠跑臺(tái)ZSPT型(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)全自動(dòng)生化儀(羅氏分析儀 COBAS-O-701)。大鼠飼料(武漢普瑞致醫(yī)生物科技有限公司),高糖高脂飼料配方:基礎(chǔ)飼料64.5%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇2%、膽酸鈉0.5%、蔗糖18%
 
1.2動(dòng)物分組及造模
 
實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,向湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購買6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠(許可證 號(hào):SCXK(鄂)2015-0018,No.42000600025097)50只。飼養(yǎng)條件為室溫20~22℃、相對(duì)濕度40%~70%,光照周期12h,自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)在武漢體育學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)房進(jìn)行。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組,每組10只,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組死亡 1只。正常對(duì)照組普通飼料喂養(yǎng),糖尿病對(duì)照組高糖高脂飼料喂養(yǎng),均籠中自由活動(dòng);低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組高糖高脂喂養(yǎng),期間分別進(jìn)行8周不同負(fù)荷的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)參照 Bedford研究,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案設(shè)計(jì)為:低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組跑臺(tái)速度為8m/min,最大攝氧量(maximal oxygen consumption,VO2max)52.9%,坡度為0 中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組跑臺(tái)速度為15m/min,VO2max 64%,坡度為5 高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組跑臺(tái)速度為20m/min,VO2max76%,坡度為10 。每周訓(xùn)練5次,每次1h共8周。于第八周末,隔夜禁食不禁水12h,正常對(duì)照組一次性腹腔注射0. 1 mmol/L的檸檬酸緩沖液(30mg/kg),糖尿病對(duì)照組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組一次性腹腔注射2%的STZ溶液(308/kg注射STZ第八天隔夜禁食,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,摘眼球取血,離心取血清,剖腹取腎臟組織,部分用于組織切片與染色;部分凍存用于 Western blot
 
檢測(cè)
 
1.3腎組織過碘酸六胺銀( periodic acid-silverine,PASM)染色
 根據(jù)常用方法制作肝組織石蠟切片,脫蠟水化后進(jìn)行PASM染色,顯微鏡下拍照。
 
1.4血清指標(biāo)檢測(cè)檢測(cè)
 
采用 ELISA法檢測(cè)血清IL-6:將已稀釋好的親和素過氧化物酶復(fù)合物工作液( avidin-biotin perozdase complex,ABC)和TMB顯色液在37℃中平衡30min。配置4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500 pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各100 1依次加入一排7孔中,1孔只加樣品稀釋液的作為零孔,直接加樣品100 蓋上酶標(biāo)板恒溫(37℃)反應(yīng)1.5h;將準(zhǔn)備好的生物素抗大鼠IL6抗體工作液按每孔1001依次加入(TMB空白顯色孔除外)。酶標(biāo)板加上封板膜,37℃反應(yīng)1h;緩沖液沖洗3次;ABC工作液按每孔100l依次加入(TMB空白顯色孔除外)。酶標(biāo)板加上封板膜,37℃反應(yīng)30min;沖洗5次,按每孔90l依次加入TMB顯色液,恒溫37℃,反應(yīng)0.5h(避光);按每孔100dl依次加入TMB終止液;用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定各孔吸光度值。采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清 2MG指標(biāo)
 
1.5 Western blot檢測(cè)腎組織TGFB1表達(dá)水平
 
剪取約50mg組織,加入總蛋白提取液,勻漿,9000r/min,4℃離心10min。蛋白濃度測(cè)定采用聚氰基丙烯酸正丁酯( bicinchoninic acid,BCA)法。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳( sodium dodecylsulfate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)上樣量40g,電壓調(diào)至100,溴酚藍(lán)遷至分離膠底部0.5cm處,出膠。免疫蛋白印跡操作轉(zhuǎn)膜,電轉(zhuǎn)完畢后,將電轉(zhuǎn)膜置于5%的脫脂奶粉[吐溫-20-三羥甲基氨甲烷緩沖鹽溶液( Tris bufieredsaline with tween20,TBST)配制]中封閉,37℃1h。一抗與靶蛋白的 結(jié)合,一抗孵育4℃過夜。TBST搖床洗滌,反復(fù)稀釋)室溫下于搖床孵育Ⅰh,TBST搖床洗滌,反復(fù)4次,每次5min。將膜浸入配制好的電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)中,室溫下孵育1min并輕輕搖動(dòng)。然后將膜放入熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),成像得到圖片
 
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
 
采用SPSS20.0數(shù)據(jù)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。切片圖像采用定性分析。定量資料以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差(x士s)表示,多組間的比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用ISDt檢驗(yàn),P 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
 
2結(jié)果
 
2.1各組大鼠腎臟PASM染色結(jié)果
 
正常對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)清晰,基底膜無明顯改變。糖尿病對(duì)照組、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組腎小球基底膜有所增厚，系膜區(qū)明顯增寬。中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組腎小球基底無明顯增厚,系膜區(qū)輕微增寬,見圖1 采用余丹等8的造模方案,即采用高糖高脂膳食方案已經(jīng)是一種理想的T2DM動(dòng)物模型造模方法,并且已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)由STZ誘導(dǎo)形成的大鼠糖尿病腎功能損害與人類相關(guān)損傷的形成非常相似10 糖尿病造模組PASM染色觀察結(jié)果顯示,其系膜區(qū)明顯增寬,同時(shí)基底膜厚度有所增加,說明產(chǎn)生一定程度的基質(zhì)成分積累,推測(cè)是腎小球功能代償性改變而低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組為低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)干預(yù),對(duì)腎小球組織結(jié)構(gòu)的改變中同樣出現(xiàn)了一定程度的腎小球基底膜及系膜區(qū)的病理改變,說明低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的干預(yù)效果欠佳。但中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的腎臟組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯的病理改變,腎小球的基底膜無明顯增厚,系膜區(qū)僅輕微增寬,說明運(yùn)動(dòng)干預(yù)糖尿病的形成過程中,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度需要達(dá)到中度及以上時(shí),對(duì)腎小球的濾過功能改善會(huì)有更好的效果。本研究顯示中、高運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,對(duì)糖尿病造模形成過程中腎臟腎小球功能的影響有一定改善。但PASM染色對(duì)腎小球基底膜的染色顯示尚缺乏精確性,腎小球基底膜的超微結(jié)構(gòu)顯示才能更好的說明其結(jié)構(gòu)與功能的狀態(tài),將在今后的課題中進(jìn)步深入研究。本研究采用的運(yùn)動(dòng)方案參考 Bedford等(研究方案,分別為52.9%VO2max、64%VO2max、76%VO2max時(shí)間長(zhǎng)度為1h,三種運(yùn)動(dòng)方案屬于長(zhǎng)時(shí)間的耐力運(yùn)動(dòng),且本次實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組的血清Il-6含量顯著低于糖尿病造模組和對(duì)照組(P 0.05)。 Hopps等研究發(fā)現(xiàn)抗炎作用與運(yùn)動(dòng)方式和強(qiáng)度以及持續(xù)時(shí)間有關(guān),與本研究
 結(jié)果相同。馬濤等2研究發(fā)現(xiàn),通過對(duì)高脂膳食大鼠進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以降低血清TNF 和IL-6水平。唐暉等研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期的耐力訓(xùn)練會(huì)降低骨骼肌IL-6mRNA的表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)單次運(yùn)動(dòng)后
 IL-6濃度明顯升高,并且收縮肌肉中釋放的ⅠL-6造成運(yùn)動(dòng)后血Il-6水平的增加13。缺乏運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪累積,促進(jìn)炎癥細(xì)胞滲透入脂肪組織,增加脂肪因子沉積并導(dǎo)致代謝性炎癥,但是長(zhǎng)期低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可增
 加抗炎因子并預(yù)防多種慢性疾病的發(fā)生。本次實(shí)驗(yàn)中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組血清Ⅰ-6水平顯著降低,體現(xiàn)岀長(zhǎng)期的中低強(qiáng)度的耐力訓(xùn)練可降低造模過程中炎癥因子水平,提升機(jī)體的抗炎能力,預(yù)防慢性炎癥對(duì)內(nèi)臟器官的進(jìn)一步損害。但本研究結(jié)果顯示高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組血清IL-6含量沒有顯著下降,可能與高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)量過大有關(guān),具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中各組間血清 2MG水平?jīng)]有顯著性
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