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細胞消化的小技巧你知道多少呢——中國生物器材網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-07-23  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):380
大部分組織細胞離體培養(yǎng)時,會以貼壁的形式生長(除了取自血、脾或骨髓的細胞);完全培養(yǎng)基中的血清,含有許多帶陽性電荷的促細胞附著因子(層黏連蛋白 Laminine、纖維鏈接蛋白 Fibronectin 等胞外基質(zhì)),能幫助細胞附著于帶陰性電荷的底物上(玻璃或塑料培養(yǎng)容器),并形成鍵結(jié)、貼壁伸展。

 

▲ 陽性電荷的促細胞附著因子,能幫助細胞附著于帶陰性電荷的底物上

所以當細胞長滿需要分盤的時后,就要想辦法讓細胞和培養(yǎng)底物說 再見!也就是所謂的~
 

細胞消化Cell Detachment

常見細胞消化法有以下三種:

物理機械法 離子螯合法 酶消化法 物理機械法

直接用液體吹打或用刮刀,施予外力讓細胞與培養(yǎng)底物分離;適用于貼壁性弱的細胞傳代,但相較于其它消化方法,這種外力無法量化控制,細胞分散效果差,且可能會造成大量細胞破損,使內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基,進而影響細胞傳代狀態(tài)。

▲細胞刮勺

離子螯合法

細胞膜表面蛋白大多需要鈣、鎂離子來維持與胞外基質(zhì)的穩(wěn)定鍵結(jié),當然也包含各種黏附蛋白(例:整合素、鈣黏著蛋白、橋粒等),螯合劑會在不破壞細胞膜表面蛋白的狀況下,抽離這些離子,使黏附蛋白失活而減少細胞-細胞間及細胞-底物間的連接作用,讓細胞較容易在施予外力時,脫離培養(yǎng)底物并促進細胞分散。

0.02% EDTA是細胞傳代最常用的離子螯合劑,在37℃作用效果最佳(消化較敏感的細胞可在4℃作用),適用于消化一般貼壁性細胞或細胞表面標記實驗細胞。

但EDTA無法用血清終止其反應,所以在消化細胞后必須用緩沖鹽溶液(如:PBS)清洗離心,以免影響后續(xù)細胞貼盤效果。

 

▲ EDTA(黑)能螯合二價離子(紅)

酶消化法

用蛋白水解酶消化連接細胞及培養(yǎng)底物的蛋白質(zhì),適用于消化貼壁性稍強的細胞。

目前常用蛋白水解酶主要有兩種:


為一種來自于胰腺的絲氨酸蛋白酶;能辨識并剪切勝肽鏈中的賴氨酸(Lys)和精氨酸( Arg)羧基端(兩者之一緊跟脯氨酸狀況除外),所以能直接作用在細胞外的黏附蛋白及胞外基質(zhì)上,但如果作用時間過長,細胞膜上內(nèi)嵌的其他蛋白也會被水解,導致細胞膜受損;不同細胞適合的胰蛋白酶使用濃度及作用時間都各有不同。

使用胰蛋白酶消化前,請先用不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液清洗細胞,因為血清中的抗凝血酶III及平衡鹽溶液中的鈣、鎂離子,都會降低胰蛋白酶活性,導致消化效果不佳;消化完畢后,可直接用含血清的培養(yǎng)基或其他胰蛋白酶抑制劑終止消化反應。

為一種膠原水解酶,大多由細菌提取而來;能辨識并剪切Pro-X-Gly-Pro勝肽序列,而此序列在胞外基質(zhì)主成分-膠原蛋白中出現(xiàn)的頻率比一般蛋白高很多,使得膠原酶能較專一的作用在胞外基質(zhì)上,所以對細胞的傷害比胰蛋白酶小,且在鈣、鎂離子環(huán)境中仍有活性,可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,操作簡便,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本。

細胞還是不愿意跟底物說再見!咋辦?

面對貼壁性極強的細胞,可進一步使用 含EDTA的胰蛋白酶 來消化細胞,EDTA會抓住細胞表面未洗凈的鈣、鎂離子,降低黏附蛋白活性使細胞不會彼此粘黏,同時讓胰蛋白酶在不受鈣、鎂離子干擾下發(fā)揮最大作用剪切胞外基質(zhì)及黏附蛋白,讓細胞順利脫離培養(yǎng)底物且減少細胞成團現(xiàn)象。

細胞消化小技巧

不一定要一次把所有細胞都要消化下來!

晃動培養(yǎng)盤并在顯微鏡下用肉眼觀察,只要70~80%細胞都收縮了或超過適合消化時間,就該終止消化反應,如果細胞量夠即可進行后續(xù)傳代或?qū)嶒灢襟E;如果細胞量不夠,則可視情況用不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液清洗仍貼壁的細胞,再進行一次消化反應。

 

▲ 消化不下來的細胞(黃)請視情況決定是否再消化一次。

不一定要吹打成完全單細胞懸液!

一般細胞脫離培養(yǎng)底物、并經(jīng)過5~10次輕柔吹打后,會在細胞懸液里形成小規(guī)模聚集(約5~10顆細胞),所以不需要過度延長消化時間想讓細胞完全分離成單細胞懸液。

消化效果不佳,先提升消化液濃度、再加長作用時間!

當你選定了一種消化方式 (物理機械法除外),發(fā)現(xiàn)效果不佳,首先應考慮提高EDTA或胰酶濃度,效果再不佳才加長消化的作用時間,避免細胞長時間浸泡在消化液中造成的細胞膜損傷。

(一般消化液使用:0.02%~0.04% EDTA作用5-20分鐘;0.2~0.5% 胰蛋白酶作用1~5分鐘)
 

結(jié)語

 細胞消化 ,是一個看似很簡單,但是有很多技術(shù)含量的步驟。消化好壞、是否污染、有無受傷,都在這短短的五六分鐘里決定。

當我們已經(jīng)可以順利操作細胞培養(yǎng)實驗,接下來要思考的,就是如何讓細胞長得更健康、更均一、做出來的實驗才會更完美。

祝各位的細胞都顆顆透亮、粒粒分明、活力旺盛!

 

BI細胞培養(yǎng)小課堂

 
 
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