人肝癌細(xì)胞系HepG2由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自BioInd公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000和Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。BDNF AS質(zhì)粒、BDNF AS與BDNF基因完全互補(bǔ)序列缺失突變質(zhì)粒以及空載體質(zhì)粒購(gòu)自上海和元生物公司。無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司。Goscript TM Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒和GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自Promega公司。BDNF AS和BDNF引物購(gòu)自O(shè)rigene公司。BDNF兔抗人一抗和GAPDH引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。 -actin小鼠抗人一抗和羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。BCA蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。
 
Alexa Fluor 594驢抗兔熒光二抗購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。Quantikine  ELISA Human BDNF Immunoassay試劑盒購(gòu)自R D Systems公司。FISH試劑盒以及Cy5標(biāo)記的lncRNA BDNF AS探針和Cy3標(biāo)記的BDNF mRNA探針由Creative Bioarray公司設(shè)計(jì)并合成, 其中, BDNF AS探針既能檢測(cè)內(nèi)源也能檢測(cè)外源轉(zhuǎn)入的lncRNA BDNF AS。
 
⒉實(shí)驗(yàn)方法
 
⑴細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
 
肝癌細(xì)胞HepG2使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 37 C、5% CO2條件培養(yǎng)。采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 3000轉(zhuǎn)染, 將BDNF AS質(zhì)粒、BDNF AS與BDNF基因完全互補(bǔ)序列缺失突變質(zhì)粒以及空載體質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞, 轉(zhuǎn)染過(guò)程按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 簡(jiǎn)述如下。轉(zhuǎn)染前24 h給細(xì)胞傳代, 保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到90%融合。用Opti-MEM稀釋Lipofectamine 3000, 同時(shí), 用Opti-MEM稀釋質(zhì)粒DNA后加入P3000混勻。
 
將稀釋好的DNA和Lipofectamin 3000混合, 室溫孵育5 min后加入細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于下述實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
 
⑵qPCR方法檢測(cè)lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平
 
Trizol提取細(xì)胞總RNA, 紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度, 取5 g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR應(yīng)用Roche LightCycler 480 Real-time PCR擴(kuò)增儀完成, 按照試劑盒提供的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。BDNFAS引物序列分別為F: 5 -TAC CAC AAG GTA CCA
ACC ATA TAT G-3 , R: 5 -CAT GTG GTT CTG TTT CAA TGC CC-3 , PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度135 bp。BDNF引物序列分別為F: 5 -CAT CCG AGG ACA AGG TGG CTT G-3 , R: 5 -GCC GAA CTT TCT GGT CCT CATC-3 , PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度161 bp。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃擴(kuò)增15 s, 60℃退火1 min, 共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參, 采用2 Ct 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
 
⑶ Western blot方法檢測(cè)BDNF蛋白質(zhì)水平
 
細(xì)胞加入RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑, 置于冰上裂解。4℃條件下離心, 取上清, 按BCA試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取80 g總蛋白, 采用12%SDS-PAGE分離, 并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后, 分別用兔抗人BDNF和小鼠抗人 -actin(1)002 4抗-4℃孵育過(guò)夜, 然后用山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1 2育孵溫室)000 2發(fā)LCE ,h 光成像。采用Image Pro-plus 6.0軟件測(cè)定每個(gè)蛋白條帶的積分光密度值, 計(jì)算同一個(gè)樣品BDNF和 -actin積分光密度之間的比值, 作為BDNF的相對(duì)表達(dá)量。
 
⑷ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中BDNF蛋白質(zhì)水平
 
離心收集細(xì)胞上清液用于檢測(cè)BDNF蛋白質(zhì)水平。ELISA實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行, 簡(jiǎn)述如下。50 L待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品用100 L檢測(cè)稀釋液稀釋后, 加到孔板中室溫孵育2 h, 加入100 LBDNF偶聯(lián)抗體室溫孵育1 h, 加入200 L底物溶液顯色。多功能酶標(biāo)儀校正波長(zhǎng)設(shè)定570 nm, 于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值。
 
⑸免疫熒光染色觀察BDNF蛋白質(zhì)水平
 
PBS漂洗細(xì)胞, 用4%多聚甲醛室溫固定, 5% BSA封閉后,向細(xì)胞中滴加兔抗人BDNF一抗(1抗驢及)釋稀002 兔熒光二抗(Alexa Fluor 594), DAPI復(fù)染細(xì)胞核, 熒光顯微鏡觀察并采集圖像, 采用Image Pro-plus 6.0軟件測(cè)定細(xì)胞的平均光密度值。
 
⑹FISH方法檢測(cè)lncRNA BDNF AS和BDNF mRNA水平和定位
 
FISH實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行, 簡(jiǎn)述如下。分別用0.2 mol/L HCl和0.3%Triton X-100室溫孵育細(xì)胞, 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞后, 向細(xì)胞中滴加RNA雜交緩沖液, 55℃預(yù)雜交2 h。將RNA探針(探針用雜交緩沖液1)釋稀002 于85℃變性5 min, 37℃保持2 min。向細(xì)胞中滴加探針, 橡膠膠水封片, 在37℃濕盒中避光雜交過(guò)夜。
 
DAPI復(fù)染細(xì)胞核, 激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus)采集圖像, 采用Image Pro-plus 6.0軟件測(cè)定細(xì)胞的平均光密度值。
 
⒊統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
 
實(shí)驗(yàn)采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。One-WayANOVA分析用于比較不同處理組細(xì)胞之間的差異,組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果用均值 標(biāo)準(zhǔn)差表示, P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。