小編前陣子去學(xué)了CPR，第一個步驟就是要先確認倒在那里的人是不是還 活著。
先生先生，你怎么了? （拍拍肩膀） 讓小編開始好奇，我的細胞 要怎么判斷他們是死是活呢？它們活的好嗎?

我們可以簡單將分析細胞活力和增殖測定的方法分成5大類：

1. 代謝增殖測定

2. DNA合成增殖試驗

3.   化學(xué)發(fā)光細胞活性測定

4. 熒光染料增殖試驗

5. 臺盼藍細胞計數(shù)

以下簡單介紹這些分類的幾種常見實驗方式吧！（所有圖片可點擊放大）

代謝增殖測定 MTT檢測法 活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，死細胞則無此現(xiàn)象。接著用二甲基亞砜（DMSO）溶解沉積在細胞中的甲瓚后，可利用酶標儀490nm波長測光吸收值，依據(jù)吸光值（OD值）計算出活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光值與細胞活性成正比（下圖1）。   XTT檢測法 與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，并利用酶標儀測定產(chǎn)物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT法還原產(chǎn)物是水溶性的橙黃色甲肷，不需經(jīng)過二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測定光吸收值（BI，貨號：20-300-1000），操作較MTT方便快速。當(dāng)XTT與電子耦合劑作用后產(chǎn)生的水溶性甲肷吸光值與活細胞數(shù)成正比（下圖2）。 圖2
DNA合成增殖試驗 BrdU檢測法 BrdU為胸腺嘧啶核苷（Thymine）的衍生物，可用于標記活細胞中新合成的DNA（細胞活性周期S期），BrdU可隨著DNA復(fù)制進入子細胞，因此在加入BrdU后分裂增殖的細胞DNA都會帶有BrdU標記，可通過抗BrdU單克隆抗體檢測，借此檢測細胞的增殖能力，但BrdU單克隆抗體檢測過程需要將部分DNA變性，使部分雙股解開成單股才能順利檢測（下圖3）。且BrdU為光敏性，因此需要在光線刺激較低（黑暗）的環(huán)境下操作，并避光培養(yǎng)。   EdU檢測法 EdU原理跟BrdU檢測法很像，都是代替胸腺嘧啶（Thymine, T）滲入正在復(fù)制的DNA中，并加入能與Edu反應(yīng)的熒光染料，即可利用檢測熒光值偵測應(yīng)用于細胞增殖，或在細胞組織級別作為標記追蹤等研究（下圖4），實驗過程不需要經(jīng)過BrdU檢測法的DNA變性處理。
圖4

化學(xué)發(fā)光細胞活性測定 ATP發(fā)光法 ATP是細胞的能量直接來源，ATP發(fā)光法是藉由檢測細胞內(nèi)ATP含量來分析細胞增殖。市面上的原理是利用外源的螢火蟲熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細胞內(nèi)含的ATP為能量來源，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物冷光，因此可通過監(jiān)測冷光光度，來對應(yīng)ATP含量并判斷細胞增殖狀況（下圖5）。
圖5

熒光染料增殖試驗 CFSE檢測法 CFSE是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有細胞膜通透性，能夠自由進入細胞；當(dāng)CFSE擴散穿過細胞膜，會與細胞內(nèi)源酯酶產(chǎn)生水解反應(yīng)而被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會進一步與細胞骨架蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞內(nèi)熒光蛋白。每當(dāng)細胞進行分裂增殖，胞內(nèi)熒光蛋白會被平均分配到下一代細胞中，因此細胞熒光強度會隨著增殖代數(shù)增加而不斷地降低（下圖6），可用流式細胞儀進一步偵測分析得出細胞分裂增殖的情況。CFSE的濃度，對于最終判斷細胞增殖結(jié)果有直接性的影響！
圖6

臺盼藍細胞計數(shù) 臺盼藍（Trypan Blue）計數(shù)法 臺盼藍（BI，貨號：03-102-1B）是一種藍色細胞活性染料，無法通過結(jié)構(gòu)完整的細胞膜進入細胞內(nèi)部；但細胞死后，喪失細胞膜穩(wěn)定性，臺盼藍會進入細胞將細胞染成藍色，因此在細胞實驗中，被常規(guī)地搭配自動細胞計數(shù)儀或血球計數(shù)板，應(yīng)用于區(qū)分辨活細胞和死細胞、及檢測細胞膜的完整性（如下圖7）。
THE END

當(dāng)然，隨著科技的日新月異，會有越來越多更精確的實驗方法等著大家去學(xué)習(xí)研究。
您實驗室都在用什么方法測定細胞活性呢? 快在下面留言跟我們分享噢！

 

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Reference

Riss, Terry L., et al.  Cell viability assays.  Assay Guidance Manual [Internet]. Eli Lilly   Company
 and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2016.