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一、培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室制備
確制備培養(yǎng)基時微生物檢驗(yàn)的最基礎(chǔ)步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分，尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應(yīng)遵守良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。培養(yǎng)基的不正確制備會導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題。
使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時，應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關(guān)數(shù)據(jù)，如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。
使用各別成分制備培養(yǎng)基時,應(yīng)按照配方準(zhǔn)確配制,記錄所有細(xì)節(jié)信息,如;培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質(zhì)含量、制造商、批號、pH、培養(yǎng)基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實(shí)施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。
1.水
除特定要求,實(shí)驗(yàn)室用水的電導(dǎo)率在25℃下應(yīng)不高于25uS/cm(相當(dāng)于電阻率 0.4M cm)。
微生物污染應(yīng)不超過103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。應(yīng)根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗(yàn)微生物的污染。
2.稱量和復(fù)水
稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊)后再加水至所需的量。
3.溶解和分裝
脫水培養(yǎng)基加水后適當(dāng)加熱,并不攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應(yīng)浸泡幾分鐘。
4.pH的測定和調(diào)整
用pH計測定pH,必要時在滅菌前調(diào)節(jié)pH，除特殊說明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。如果滅菌后調(diào)節(jié)pH，溶液需滅菌。
注:商品化培養(yǎng)基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調(diào)節(jié)pH。
5.分裝
將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦校萜鞯捏w積至少為體積的1.2倍。
6.滅菌
①概述
培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。
有些培養(yǎng)基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養(yǎng)基對光和熱特別敏感，應(yīng)在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)廠商的使用說明）。
②濕熱滅菌
濕熱滅菌在高壓鍋或培養(yǎng)基制備器中進(jìn)行。高壓霉菌一般采用121℃ 3℃霉菌15min。如果培養(yǎng)基的體積超過1000mL，要對滅菌條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。所有操作均要按照標(biāo)準(zhǔn)和使用說明的規(guī)定進(jìn)行。
注：大容量培養(yǎng)基（＞1000mL）滅菌時可能會造成過度加熱。
加熱后應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆绞嚼鋮s，防止沸溢。這對大容量培養(yǎng)基和敏感性培養(yǎng)基（如含亮綠的培養(yǎng)基）是非常重要的。
③過濾滅菌
過濾滅菌可以在真空負(fù)壓或正壓條件下進(jìn)行。使用無菌設(shè)備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預(yù)消毒設(shè)備。
一些濾膜上附著蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如抗生素)。為達(dá)到有效過濾,應(yīng)事先將濾膜用無菌水潤濕。
④監(jiān)測
應(yīng)對經(jīng)濕熱或過濾滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)行監(jiān)測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。
7.添加劑的制備
制備含有有毒物質(zhì)(特別是抗生素）時應(yīng)小心操作，避免因粉末的擴(kuò)散造成實(shí)驗(yàn)人員過敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。采用適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施并小心按照產(chǎn)品使用說明操作。不要使用過期的試劑；抗生素工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應(yīng)提供冷凍對抗生素活性影響的相關(guān)資料，也可由使用者自行測定。
二、培養(yǎng)基的使用
1.瓊脂培養(yǎng)基的融化
將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養(yǎng)基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min），以免玻璃容器發(fā)生破裂。
融化后的培養(yǎng)基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫，冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養(yǎng)基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內(nèi)培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時間一般不超過4h。剩余的培養(yǎng)基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養(yǎng)基，應(yīng)根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，縮短融化后放置的時間。
將瓊脂培養(yǎng)基倒入類似檢測培養(yǎng)使用的獨(dú)立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。
加入樣品的培養(yǎng)基應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)到44℃~47℃，或按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)溫度。
2.培養(yǎng)基的脫氣
必要時，在使用前將養(yǎng)基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子；加熱后蓋緊蓋子，并迅速冷卻至使用溫度。
3.添加成分的加入
對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應(yīng)冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養(yǎng)基并充分混勻，盡快分裝到待用的容器中。
4.培養(yǎng)基的棄置
所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置應(yīng)采用安全的方式,并符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。
三、平板的制備和儲存
傾注融化后的培養(yǎng)基到平皿中,使之在乎皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直經(jīng)90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養(yǎng)基),或根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使指冷卻凝固。如果平板要儲存、培養(yǎng)時間超過48h或培養(yǎng)溫度超過40℃，要增加培養(yǎng)基的傾注量。
注：在培養(yǎng)過程中,瓊脂培養(yǎng)基會損失水分,在某些環(huán)境條件下會影響微生物的生長。,造成培養(yǎng)基水分損失的因素很多,如培養(yǎng)基的成分、平皿中培養(yǎng)基的量、培養(yǎng)箱的類型(如使用帶風(fēng)扇的培養(yǎng)箱)、培養(yǎng)箱里的空氣濕度、平皿在培養(yǎng)箱中放置的位置和數(shù)量以及培養(yǎng)溫度等。
凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放在防止其成分發(fā)生變化的條件下,如存放于暗處和(或)5℃ 3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或側(cè)面做好標(biāo)記,標(biāo)記的內(nèi)容包括培養(yǎng)基名稱、制備日期和(或)有效期,也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。
將傾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產(chǎn)生,平板應(yīng)冷卻后再裝入密封袋中。貯存前不要對培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理。
對于采用表面接種的固體培養(yǎng)基,應(yīng)先對瓊脂表面進(jìn)行干燥：揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱/培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)置為25℃~50℃)；或放在有對流風(fēng)的無菌凈化臺中,直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商業(yè)化的平板脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。
四、疑難解答
1.培養(yǎng)基不能凝固
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②低pH值造成培養(yǎng)基酸解
③瓊脂使用量不正確
④瓊脂未完全溶解
⑤培養(yǎng)基成分未充分混勻
2.pH值不正確
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②水質(zhì)不佳
③外部化學(xué)物質(zhì)污染
④在不正確溫度下測量pH值
⑤pH計未正確校準(zhǔn)
⑥脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
3.顏色異常
①培養(yǎng)基制備過程中過度加
②水質(zhì)不佳
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
④pH值不正確
⑤外來污染
4.產(chǎn)生沉淀
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②水質(zhì)不佳
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
④pH值未正確控制
⑤如果是各別成分制備的培養(yǎng)基---原材料不純
5.培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制/生長率低
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②水質(zhì)不佳
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
④配方使用不對
⑤添加成分不正確，如加入添加成分時培養(yǎng)基過熱或添加濃度錯誤
⑥添加物被污染
6.污染
①滅菌不充分
②無菌操作有誤
③添加物被污染
確制備培養(yǎng)基時微生物檢驗(yàn)的最基礎(chǔ)步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分，尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應(yīng)遵守良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。培養(yǎng)基的不正確制備會導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題。
使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時，應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關(guān)數(shù)據(jù)，如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。
使用各別成分制備培養(yǎng)基時,應(yīng)按照配方準(zhǔn)確配制,記錄所有細(xì)節(jié)信息,如;培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質(zhì)含量、制造商、批號、pH、培養(yǎng)基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實(shí)施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。
1.水
除特定要求,實(shí)驗(yàn)室用水的電導(dǎo)率在25℃下應(yīng)不高于25uS/cm(相當(dāng)于電阻率 0.4M cm)。
微生物污染應(yīng)不超過103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。應(yīng)根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗(yàn)微生物的污染。
2.稱量和復(fù)水
稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊)后再加水至所需的量。
3.溶解和分裝
脫水培養(yǎng)基加水后適當(dāng)加熱,并不攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應(yīng)浸泡幾分鐘。
4.pH的測定和調(diào)整
用pH計測定pH,必要時在滅菌前調(diào)節(jié)pH，除特殊說明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。如果滅菌后調(diào)節(jié)pH，溶液需滅菌。
注:商品化培養(yǎng)基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調(diào)節(jié)pH。
5.分裝
將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦校萜鞯捏w積至少為體積的1.2倍。
6.滅菌
①概述
培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。
有些培養(yǎng)基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養(yǎng)基對光和熱特別敏感，應(yīng)在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或生產(chǎn)廠商的使用說明）。
②濕熱滅菌
濕熱滅菌在高壓鍋或培養(yǎng)基制備器中進(jìn)行。高壓霉菌一般采用121℃ 3℃霉菌15min。如果培養(yǎng)基的體積超過1000mL，要對滅菌條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。所有操作均要按照標(biāo)準(zhǔn)和使用說明的規(guī)定進(jìn)行。
注：大容量培養(yǎng)基（＞1000mL）滅菌時可能會造成過度加熱。
加熱后應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆绞嚼鋮s，防止沸溢。這對大容量培養(yǎng)基和敏感性培養(yǎng)基（如含亮綠的培養(yǎng)基）是非常重要的。
③過濾滅菌
過濾滅菌可以在真空負(fù)壓或正壓條件下進(jìn)行。使用無菌設(shè)備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預(yù)消毒設(shè)備。
一些濾膜上附著蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如抗生素)。為達(dá)到有效過濾,應(yīng)事先將濾膜用無菌水潤濕。
④監(jiān)測
應(yīng)對經(jīng)濕熱或過濾滅菌的培養(yǎng)基進(jìn)行監(jiān)測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。
7.添加劑的制備
制備含有有毒物質(zhì)(特別是抗生素）時應(yīng)小心操作，避免因粉末的擴(kuò)散造成實(shí)驗(yàn)人員過敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。采用適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施并小心按照產(chǎn)品使用說明操作。不要使用過期的試劑；抗生素工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應(yīng)提供冷凍對抗生素活性影響的相關(guān)資料，也可由使用者自行測定。
二、培養(yǎng)基的使用
1.瓊脂培養(yǎng)基的融化
將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養(yǎng)基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min），以免玻璃容器發(fā)生破裂。
融化后的培養(yǎng)基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫，冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養(yǎng)基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內(nèi)培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時間一般不超過4h。剩余的培養(yǎng)基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養(yǎng)基，應(yīng)根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，縮短融化后放置的時間。
將瓊脂培養(yǎng)基倒入類似檢測培養(yǎng)使用的獨(dú)立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。
加入樣品的培養(yǎng)基應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)到44℃~47℃，或按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)溫度。
2.培養(yǎng)基的脫氣
必要時，在使用前將養(yǎng)基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子；加熱后蓋緊蓋子，并迅速冷卻至使用溫度。
3.添加成分的加入
對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應(yīng)冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養(yǎng)基并充分混勻，盡快分裝到待用的容器中。
4.培養(yǎng)基的棄置
所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置應(yīng)采用安全的方式,并符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。
三、平板的制備和儲存
傾注融化后的培養(yǎng)基到平皿中,使之在乎皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直經(jīng)90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養(yǎng)基),或根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使指冷卻凝固。如果平板要儲存、培養(yǎng)時間超過48h或培養(yǎng)溫度超過40℃，要增加培養(yǎng)基的傾注量。
注：在培養(yǎng)過程中,瓊脂培養(yǎng)基會損失水分,在某些環(huán)境條件下會影響微生物的生長。,造成培養(yǎng)基水分損失的因素很多,如培養(yǎng)基的成分、平皿中培養(yǎng)基的量、培養(yǎng)箱的類型(如使用帶風(fēng)扇的培養(yǎng)箱)、培養(yǎng)箱里的空氣濕度、平皿在培養(yǎng)箱中放置的位置和數(shù)量以及培養(yǎng)溫度等。
凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放在防止其成分發(fā)生變化的條件下,如存放于暗處和(或)5℃ 3℃冰箱的密封袋中。在平板的底部或側(cè)面做好標(biāo)記,標(biāo)記的內(nèi)容包括培養(yǎng)基名稱、制備日期和(或)有效期,也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。
將傾注好的平板放在密封袋中冷蔵可延長儲存期限。為了避免冷凝水的產(chǎn)生,平板應(yīng)冷卻后再裝入密封袋中。貯存前不要對培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理。
對于采用表面接種的固體培養(yǎng)基,應(yīng)先對瓊脂表面進(jìn)行干燥：揭開平皿蓋,將平板倒扣于烘箱/培養(yǎng)箱中(溫度設(shè)置為25℃~50℃)；或放在有對流風(fēng)的無菌凈化臺中,直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥。商業(yè)化的平板脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。
四、疑難解答
1.培養(yǎng)基不能凝固
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②低pH值造成培養(yǎng)基酸解
③瓊脂使用量不正確
④瓊脂未完全溶解
⑤培養(yǎng)基成分未充分混勻
2.pH值不正確
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②水質(zhì)不佳
③外部化學(xué)物質(zhì)污染
④在不正確溫度下測量pH值
⑤pH計未正確校準(zhǔn)
⑥脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
3.顏色異常
①培養(yǎng)基制備過程中過度加
②水質(zhì)不佳
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
④pH值不正確
⑤外來污染
4.產(chǎn)生沉淀
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②水質(zhì)不佳
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
④pH值未正確控制
⑤如果是各別成分制備的培養(yǎng)基---原材料不純
5.培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制/生長率低
①培養(yǎng)基制備過程中過度加熱
②水質(zhì)不佳
③脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差
④配方使用不對
⑤添加成分不正確，如加入添加成分時培養(yǎng)基過熱或添加濃度錯誤
⑥添加物被污染
6.污染
①滅菌不充分
②無菌操作有誤
③添加物被污染
