在之前的文章中（領(lǐng)往昔風(fēng)云，看今日OpenSPR、Biacore和Fortebio孰強(qiáng)孰弱），我們通過實(shí)驗(yàn)對比了市面上主流的無標(biāo)記分子間相互作用檢測技術(shù)。今天我們來聊聊基于熒光標(biāo)記的分子間相互作用檢測技術(shù)。

       同無標(biāo)記技術(shù)相比，利用熒光技術(shù)檢測分子間相互作用的實(shí)驗(yàn)成本較低，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，無需昂貴的儀器便可完成結(jié)合分析。然而，基于熒光標(biāo)記的檢測技術(shù)也存在自己的局限性，像凝膠遷移實(shí)驗(yàn)就只能用來檢測蛋白和核酸間的相互作用。那么在具體的實(shí)驗(yàn)中，研究人員該如何選擇合適的檢測技術(shù)呢？不要著急，下面我們便為大家介紹最常見的熒光結(jié)合分析技術(shù)，為您提供一些思路。

熒光偏振（FP）

       熒光偏振技術(shù)利用偏振光激發(fā)探針上的熒光基團(tuán)，根據(jù)探針遷移狀態(tài)的不同，發(fā)射光為偏振光或非偏振光。例如生物大分子旋轉(zhuǎn)相對較慢，由偏振光激發(fā)后會產(chǎn)生偏振信號。而小分子由于旋轉(zhuǎn)較快會導(dǎo)致信號去極化。通過分析發(fā)射光的偏振信號強(qiáng)度便可快速定量分析分子間的相互作用及酶活性檢測。

       熒光偏振技術(shù)非常適用于高通量篩選實(shí)驗(yàn)，但是不能得到結(jié)合動力學(xué)參數(shù)（結(jié)合/解離速率常數(shù)），且熒光基團(tuán)可能會對分子間的結(jié)合產(chǎn)生影響，需要用其他技術(shù)手段加以驗(yàn)證。中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院發(fā)表的文章Luteolin inhibits Musashi1 binding to RNA and disrupts cancer phenotypes in glioblastoma cells就是利用該技術(shù)高通量篩選靶向癌癥相關(guān)蛋白的小分子抑制劑，之后使用我們的LSPR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）

       熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指在兩個不同的熒光基團(tuán)中，如果一個熒光基團(tuán)（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團(tuán)（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個熒光基團(tuán)間的距離合適時（一般小于100 ），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。這樣我們就可以檢測分別帶有供體和受體基團(tuán)的融合蛋白間的相互作用。同其他技術(shù)相比，F(xiàn)RET最大的優(yōu)勢是可用于研究活細(xì)胞生理條件下的蛋白間相互作用。但可檢測的樣品種類較少，目前僅適用于蛋白、核酸的檢測。同樣，由于熒光基團(tuán)的介入，可能會對分子間的相互作用產(chǎn)生影響。

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）

       凝膠遷移實(shí)驗(yàn)又稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一種用于蛋白與核酸相互作用檢測的技術(shù)。最初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。EMSA主要基于蛋白-探針復(fù)合物在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物；這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，若蛋白-探針復(fù)合物在膜靠前的位置形成一條帶，則說明蛋白與目標(biāo)探針之間有相互作用。

       EMSA技術(shù)門檻、實(shí)驗(yàn)成本都比較低，但僅適用于蛋白和核酸的互作檢測，實(shí)驗(yàn)流程相對繁瑣。在Novel dual regulators of Pseudomonas aeruginosa essential for productive biofilms and virulence這篇文章中，研究人員首先使用EMSA檢測蛋白與核酸間的相互作用，在發(fā)現(xiàn)蛋白與核酸間的相互作用需要輔助調(diào)節(jié)因子參與后，使用我們的LSPR技術(shù)進(jìn)行了快速的驗(yàn)證。

微量熱泳動（MST）

微量熱泳動技術(shù)使用紅外激光進(jìn)行加熱產(chǎn)生一個微觀的溫度梯度場，導(dǎo)致分子定向移動，再通過共價結(jié)合的熒光染料或色氨酸自發(fā)熒光來監(jiān)測觀測區(qū)域的熒光信號的變化從而計算兩個相互作用分子間的KD等常數(shù)。MST技術(shù)不需要表面固定，可以在溶液中檢測任何生物分子、化合物、納米材料等分子間的相互作用，應(yīng)用范圍較廣。但無法提供結(jié)合動力學(xué)參數(shù)（結(jié)合/解離速率常數(shù)）,且共價結(jié)合的染料可能會對分子間的相互作用產(chǎn)生影響。

綜上所述，同無標(biāo)記分子間相互作用檢測技術(shù)相比，基于熒光標(biāo)記的分子間相互作用檢測技術(shù)有以下共同點(diǎn)：

無法提供結(jié)合動力學(xué)參數(shù)（結(jié)合/解離速率常數(shù)）

熒光基團(tuán)可能會對分子間的結(jié)合產(chǎn)生影響

通常需要使用其他技術(shù)驗(yàn)證

表面等離子共振技術(shù)（SPR）作為分子間相互作用檢測金標(biāo)準(zhǔn)，無需對生物分子進(jìn)行標(biāo)記，檢測數(shù)據(jù)更加精確。除了兩個分子間親和力大小外，還能提供結(jié)合動力學(xué)參數(shù)（結(jié)合/解離速率常數(shù)），幫助研究人員更加深入的理解生物結(jié)合過程、藥物作用機(jī)制。加拿大Nicoya公司的OpenSPR極大的減低了傳統(tǒng)SPR儀器的操作難度，同時采用簡單穩(wěn)定的光學(xué)系統(tǒng)及大孔徑流路，讓使用者遠(yuǎn)離高昂的維護(hù)費(fèi)用。

Nicoya OpenSPR分子相互作用儀在研究中的優(yōu)勢

多參數(shù)檢測---Ka、Kd、KD、EC50、蛋白濃度測定

創(chuàng)新LSPR技術(shù)--- 檢測不受溫度、緩沖液折射率影響

易操作---1-2小時快速掌握

寬范圍檢測---pM-mM

低成本--- 實(shí)時無標(biāo)記、芯片可再生