“眼見為實”的行為準則在某種程度上極大促進了人類科學的發(fā)展，這也使得科學家們早在1658年就能用顯微鏡對細胞進行成像。從那時起，顯微鏡技術已經(jīng)顯著地現(xiàn)代化，并且隨著熒光顯微鏡和三維顯微鏡的使用，顯微鏡技術已經(jīng)成為細胞生物學實驗室中無處不在的工具。

看到的信息越多，對細胞的認識便更進一步。隨著細胞成像技術的不斷發(fā)展，人類正朝著能看到更多信息的方向邁進。同時，看到更多的基礎上，成像的質(zhì)量也并不會受損失：顯微鏡工具可以在更高的分辨率下以驚人的精度獲得更多的信息，更重要的是，在最小擾動下活細胞條件下觀察?？茖W家們現(xiàn)在可以常規(guī)地可視化單個細胞器，繪制染色體位點的運動圖，感知機械力，并連續(xù)幾天以高通量的方式成像細胞。接下來，將從五個方面介紹細胞顯微成像技術的最新進展，以進一步認識該領域的發(fā)展方向。

1、布里淵光學顯微鏡（Brillouin microscopy）

布里淵顯微鏡是一種非侵入性、無標簽的方法，可以在三維空間中以衍射限制分辨率探測生物樣品的粘彈性性質(zhì)。區(qū)別于原子力顯微鏡，它的優(yōu)點是不接觸。在病變組織中，細胞和組織的力學特性經(jīng)常發(fā)生改變，因此對理解病理學機制具有重要意義。布里淵光散射是圍繞光與自發(fā)熱致密度波動的相互作用而展開的。從散射光譜2的頻移可以推斷出諸如剛度的機械特性。這使得許多類型的生物測量成為可能，例如全細胞中細胞內(nèi)生物力學特性的3D映射，或腸的成像。然而，用這種顯微鏡技術仍然有待解決的挑戰(zhàn)，數(shù)據(jù)需要特別仔細的解讀，因為一些人認為布里淵測量可能主要由水化作用而不是剛度效應來決定的。

2、CRISPR標記熒光成像（CRISPR-labeled fluorescence imaging）

CRISPR無疑已經(jīng)徹底改變了基因編輯和調(diào)控，在這一過程中，它也促進了細胞顯微鏡技術的發(fā)展。與僅對固定細胞成像的常規(guī)原位雜交研究相反，研究小組已經(jīng)用它來標記已定義的染色體位點，以便在活細胞中成像基因組的三維結(jié)構。利用Cas9和單導向RNA(sgRNA)結(jié)合熒光蛋白，Ma等人最近實現(xiàn)了對單個活細胞中多達6個染色體位點的同步成像，他們稱之為CRISPRainbow技術。原則上，他們解釋說，只要在CRISPRainbow上再添加一種顏色，就可以將同時檢測基因組位點的活細胞數(shù)量增加到15個。

3、光片顯微鏡（Light sheet microscopy）

光片熒光顯微鏡(LSFM)只照亮樣品的薄成像焦平面，并檢測來自該特定平面的熒光，從而最大限度地減少離焦熒光和光漂白。這意味著無需切片就能觀察到生物體和細胞的動態(tài)。直到最近，分辨率還不允許亞細胞成像的視野大到足以容納幾個細胞。事實上，組織的光學異質(zhì)性會導致像差，隨著成像深度的增加，像差會迅速影響分辨率、信號和對比度。雖然貝塞爾光束和點陣光片已經(jīng)取得了進展，但這種技術仍然復雜且昂貴。在2019年，Chang等人描述了一種新的場合成方法，它有助于使用更簡單的光學器件的光片。這種方法將LSFM與自適應光學相結(jié)合，通過改變鏡子的形狀來產(chǎn)生相等但相反的畸變，從而補償光學畸變。它需要更少的功率，最大限度地減少光漂白，并允許在同一時間以高分辨率成像多種顏色。這使得Liu等人能夠通過檢測角蛋白包被的凹坑在人類干細胞衍生的類器官或斑馬魚的背尾區(qū)域中的擴散，在納米尺度上對內(nèi)吞作用進行成像。并幫助他們在斑馬魚胚胎發(fā)生過程中用細節(jié)細胞器動態(tài)顯示，和體內(nèi)神經(jīng)元，癌癥或免疫細胞的3D細胞遷移。這一突破有望徹底改變定量亞細胞4D細胞生物學。

4、全息斷層掃描顯微鏡（Holo-tomographic microscopy）

全息斷層掃描顯微鏡（HTM）是一種定量相位顯微鏡方法，其中物體的復雜波場被編碼成全息圖，并且與樣本的旋轉(zhuǎn)掃描相結(jié)合。這導致快速三維重建的實時樣品的折射率分布的分辨率低于Rayleigh準則定義的光的衍射極限。該技術的一個關鍵優(yōu)點是它傳輸給樣品的能量低，確保低光毒性，允許在不受干擾的情況下研究亞細胞動力學。無散射系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)出來，允許亞細胞高分辨率成像，例如通過融合和裂變循環(huán)的單個線粒體成像。使用這種技術，Sandoz等人首次報道了小鼠胚胎干細胞(mESCs)有絲分裂前細胞重組的細胞器旋轉(zhuǎn)。在有絲分裂前80分鐘，他們觀察細胞核、核仁、核膜、脂滴和線粒體的旋轉(zhuǎn)，這表明細胞分裂前物質(zhì)重新分布的潛在機制有待進一步研究。

5、高內(nèi)涵分析顯微鏡（High content-analysis microscopy）

看得更多不僅僅是為了達到高分辨率，它還意味著看得更久。科學家們意識到，短時間成像細胞，或在離散時間點成像細胞，可能意味著它們錯過了關鍵的細胞動力學。這就是為什么現(xiàn)在開發(fā)的系統(tǒng)可以對樣品進行連續(xù)成像。一方面，一些顯微鏡正在開發(fā)中，它們可以集成在孵卵器中，隨著細胞不斷生長，它們可以在二維時間內(nèi)追蹤細胞。類似地，一些培養(yǎng)箱被設計成包含攝像機，可以對任何測試進行連續(xù)成像，從而能夠在同一個培養(yǎng)箱中對多個樣本進行成像。另一方面，為了設計數(shù)據(jù)豐富的實驗，目前正在開發(fā)高通量系統(tǒng)，以便能夠長時間地研究孔板中的更多細胞分析。例如，Anastasov等人培養(yǎng)了大量由癌癥和基質(zhì)細胞組成的腫瘤球體，并對其成像14天，以量化它們在不同放療和化療組合下的生長。這種高含量的裝置使他們能夠篩選大量的化療藥物，以及它們與輻射的結(jié)合，從而確定長春堿是一種射電致敏劑，與單獨使用長春堿的試驗相比，它在減小球體大小方面更有效。

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