金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人類(lèi)的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有 嗜肉菌 的別稱(chēng)，是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。而對(duì)于金黃色葡萄球菌在速凍食品中的存在量，衛(wèi)生部于2011年11月24日公布食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《速凍面米制品》，允許金葡菌限量存在。今天我們主要來(lái)了解一下它的檢測(cè)方法。
一、材料與方法
1、材料
①培養(yǎng)基：7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基，血瓊脂平板培養(yǎng)基（按常規(guī)方法制作）
②試劑：7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基，革蘭氏染色，血瓊脂平板，Baird-Parker瓊脂平板，生理鹽水，兔血漿（1：4）
③器材：溫箱，顯微鏡，天平，均質(zhì)器，載玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，試管及試管架，研磨，1ml注射器，
④實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康的小白鼠
2、方法
待檢樣品25g+225ml 滅菌生理鹽水
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直接計(jì)數(shù)法 增菌培養(yǎng)方法

Baird-Parker瓊脂平板 7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基

血平板 血平板
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涂片染色鏡 溶血觀察 動(dòng)物接種試驗(yàn) 血漿凝固試驗(yàn)
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報(bào)告
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣品的采集
稱(chēng)取25g火腿腸，切碎攪勻（用滅菌研缽研磨），置于250ml 錐形瓶中，加入225ml 滅菌生理鹽水，制成1：10樣品混懸液，混勻后作用20分鐘，隨機(jī)取10ml 離心。
2、增菌及分離培養(yǎng)
①增菌培養(yǎng)方法：吸取5ml上清液，接種于7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置于（37 1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h，劃線接種入血平板，（37 1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h。
②直接計(jì)數(shù)方法：吸取上述懸液，進(jìn)行10倍遞增稀釋?zhuān)鶕?jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液各1ml，分別加入3個(gè)Baird-Parker瓊脂平板，每個(gè)平板的接種量分別為0.3ml、0.3ml、0.4ml。用滅菌L型涂布棒涂布整個(gè)平板，置于（37 1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h。之后分別對(duì)3個(gè)平板上生長(zhǎng)的周?chē)袦啙釒У暮谏溥M(jìn)行計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)接入血平板，（37 1℃）恒溫箱中培養(yǎng)24h。
3、涂片、染色與鏡檢
將純培養(yǎng)的未知菌涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀察。
4、生化實(shí)驗(yàn)
①觸酶試驗(yàn)
在載玻片上滴1滴3%的過(guò)氧化氫，調(diào)取純化的細(xì)菌放在過(guò)氧化氫中觀察變化。30s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。
②血漿凝固酶試驗(yàn)
吸取1：4新鮮兔血漿0.5ml，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的2①中的肉湯培養(yǎng)液0.5ml，搖蕩均勻，放入（37 1℃）恒溫箱中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，觀察6h，檢查是否出現(xiàn)凝固。將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊狀，可判定為陽(yáng)性，同時(shí)以已知陽(yáng)性葡糖球菌和陰性肉湯作為對(duì)照。
5、動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)
用無(wú)菌生理鹽水將2①中血瓊脂板上純化的菌落洗下后，以0.5ml/只腹腔注射入小白鼠體內(nèi)，同時(shí)用滅菌生理鹽水注射入另外的小白鼠體內(nèi)，以做對(duì)照，分別在相同條件飼養(yǎng)，觀察其癥狀。對(duì)感染試驗(yàn)出現(xiàn)癥狀或死亡的小白鼠進(jìn)行剖檢，并采集病料，進(jìn)行分離。
三、結(jié)果與分析
1、培養(yǎng)特性及形態(tài)特征
①培養(yǎng)特性
在37℃條件下，需氧與厭氧培養(yǎng)的血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板均長(zhǎng)出光滑、濕潤(rùn)、隆起，約1mm大小的金黃色菌落，并且有 溶血現(xiàn)象。
②鏡檢結(jié)果
顯微鏡下觀察該菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列成葡萄串狀，也有個(gè)別2個(gè)或3個(gè)球菌相連。根據(jù)菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)果懷疑該菌為葡萄球菌。
2、菌落計(jì)數(shù)報(bào)告
將直接計(jì)數(shù)法試驗(yàn)中的3個(gè)平板中疑似黑色葡萄球菌的金黃色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性數(shù)，除以5，在乘以稀釋倍數(shù)，即為每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)量。
3、動(dòng)物感染試驗(yàn)
只注生理鹽水的小白鼠沒(méi)有任何變化：接種分離菌的小白鼠在9h內(nèi)死亡。將死亡的小白鼠剖檢采集病料，進(jìn)行細(xì)菌分離和生化試驗(yàn)，得到與原分離菌。
金球菌 列為 極重要質(zhì)量項(xiàng)目
金黃色葡萄球菌因思念、三全、灣仔碼頭事件而引發(fā)標(biāo)準(zhǔn)爭(zhēng)議，在2011年12月21日實(shí)施的速凍食品新國(guó)標(biāo)中，金黃色葡萄球菌從原來(lái) 不得檢出 變?yōu)?限量檢出 ，但這一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的改變并不代表可以忽略金黃色葡萄球菌的危害性。
在市質(zhì)監(jiān)局征集意見(jiàn)而公示的抽檢項(xiàng)目中查詢到，對(duì)包括速凍水餃、湯圓、包子、花卷、饅頭、南瓜餅、八寶飯等在內(nèi)的速凍米面食品，仍然計(jì)劃把金黃色葡萄球菌列入A類(lèi)檢驗(yàn)項(xiàng)目，并標(biāo)注為 極重要質(zhì)量項(xiàng)目 ，同時(shí)速凍米面食品的沙門(mén)氏菌也是A類(lèi)檢驗(yàn)。
速凍食品 金球菌 可限量檢出
中國(guó)現(xiàn)行《速凍預(yù)包裝面米食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB19295－2003）規(guī)定金黃色葡萄球菌等致病菌不得檢出。
而衛(wèi)生部于2012年12月21日實(shí)施的《速凍面米制品食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》，將金黃色葡萄球菌檢測(cè)由定性轉(zhuǎn)向定量，規(guī)定每批產(chǎn)品抽檢5個(gè)樣品中，至多只能有1個(gè)樣品每克生制品中檢出的金黃色葡萄球菌含量在1000至10000個(gè)之間。