1. 貼壁細(xì)胞,細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,計(jì)數(shù),并收集5 106 個(gè)細(xì)胞,600g 離心5分鐘,盡量吸盡上清,用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,600g 離心5分鐘收集細(xì)胞,盡量吸盡上清,加入0.5ml的預(yù)冷的裂解液,用移液器吹打數(shù)下,冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。
注意:可以直接將裂解液加入培養(yǎng)細(xì)胞的器皿中裂解細(xì)胞,具體操作如下,
A.用移液槍小心吸去培養(yǎng)液,
B.加入適量的預(yù)冷的PBS,
C.用移液槍小心吸去PBS,
D.按照下表加入裂解液,冰上孵育30分鐘。
E.將裂解液轉(zhuǎn)入離心管中, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。
2.懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù),并收集5 106 個(gè)細(xì)胞,600g 離心5分鐘,盡量吸盡上清,用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,600g 離心5分鐘收集細(xì)胞,盡量吸盡上清,加入0.5ml的預(yù)冷的裂解液,用移液器吹打數(shù)下,冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。
對(duì)于組織:
注意:取適當(dāng)量的裂解液,放與4℃預(yù)冷,使用前數(shù)分鐘內(nèi)需加入酶抑制劑。
1. 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中,漂洗數(shù)次,洗凈組織血跡,用濾紙吸干組織表面液體,將組織切成幾個(gè)較小的組織塊。
2. 稱量組織,按組織凈重(g):裂解液(ml)=1:10的比例,加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿 ,(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。
3. 勻漿器勻漿,肉眼觀察無(wú)明顯組織塊,冰上孵育30分鐘。
4. 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。
結(jié)果實(shí)例:
M N M N M N
DSG3 HSP90 PCNA
M:Hela Cells N:A549 Cells
如圖:增強(qiáng)型RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA測(cè)定蛋白濃度,上樣20ug,電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育博士德一抗,應(yīng)用博士德ECL發(fā)光液顯色。
故障排除: