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增強(qiáng)型RIPA裂解液使用說(shuō)明書——中國(guó)生物器材網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-06-25  來(lái)源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):800

1.  貼壁細(xì)胞,細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,計(jì)數(shù),并收集5 106 個(gè)細(xì)胞,600g 離心5分鐘,盡量吸盡上清,用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,600g 離心5分鐘收集細(xì)胞,盡量吸盡上清,加入0.5ml的預(yù)冷的裂解液,用移液器吹打數(shù)下,冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

注意:可以直接將裂解液加入培養(yǎng)細(xì)胞的器皿中裂解細(xì)胞,具體操作如下,

A.用移液槍小心吸去培養(yǎng)液,

B.加入適量的預(yù)冷的PBS,

C.用移液槍小心吸去PBS,

D.按照下表加入裂解液,冰上孵育30分鐘。

E.將裂解液轉(zhuǎn)入離心管中, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。



2.懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù),并收集5 106 個(gè)細(xì)胞,600g 離心5分鐘,盡量吸盡上清,用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,600g 離心5分鐘收集細(xì)胞,盡量吸盡上清,加入0.5ml的預(yù)冷的裂解液,用移液器吹打數(shù)下,冰上孵育30分鐘, 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

對(duì)于組織:

注意:取適當(dāng)量的裂解液,放與4℃預(yù)冷,使用前數(shù)分鐘內(nèi)需加入酶抑制劑。

1. 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中,漂洗數(shù)次,洗凈組織血跡,用濾紙吸干組織表面液體,將組織切成幾個(gè)較小的組織塊。

2. 稱量組織,按組織凈重(g):裂解液(ml)=1:10的比例,加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿 ,(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量)。

3. 勻漿器勻漿,肉眼觀察無(wú)明顯組織塊,冰上孵育30分鐘。

4. 10000g離心10分鐘,取上清,即為蛋白提取物。

 

結(jié)果實(shí)例: 

   M        N                M         N                 M         N 

      

          DSG3                     HSP90                      PCNA

M:Hela Cells  N:A549 Cells

如圖:增強(qiáng)型RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA測(cè)定蛋白濃度,上樣20ug,電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育博士德一抗,應(yīng)用博士德ECL發(fā)光液顯色。

故障排除:

 
關(guān)鍵詞: 裂解 組織 預(yù)冷 孵育 勻漿
 
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