EvaGreen 是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。作為新一代的綠色熒光核酸染料EvaGreen ，具有如下三個優(yōu)勢：

1.對PCR 的抑制小，因此在實驗中EvaGreen 可使用快速PCR 溫度循環(huán)，同時可以使用較高濃度，提高亮度的同時也消除了 染料重新分布 ；

2.穩(wěn)定性極強，在儲存、操作和PCR過程中不會被破壞，可以反復凍融；

3.降低了細胞膜透性，更加安全。

染料法dPCR實驗反應體系含有一對用于擴增目的序列的特異區(qū)段的PCR引物和用于擴增產(chǎn)物使用的EvaGreen 染料。

EvaGreen 實驗的步驟如下

1.引物和擴增子設計

引物設計的原則在qPCR和digital PCR中是一樣的。具體的設計原則可以參照前面發(fā)表的引物探針設計原則。

2.實驗準備

對于任何數(shù)字PCR實驗需要準備：

數(shù)字PCR儀及專用耗材

PCR mix包含酶，dNTPs，buffer，Mg+

Evagreen

dH2O

普通PCR實驗用品：tube chip 振蕩器 離心機等。

3.反應體系

按如下反應體系配置MIX：

4.反應條件

*：根據(jù)實驗引物的Tm值來決定

5.數(shù)據(jù)采集

根據(jù)所使用的系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集將采用芯片成像的形式(Naica 系統(tǒng)、QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)、ConSTELLATION 數(shù)字PCR系統(tǒng) )，或者類似于流式細胞術(QX200 液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)、Raindrop 數(shù)字PCR系統(tǒng))，逐個讀取分區(qū)。請按照制造商的說明執(zhí)行此步驟。

6.數(shù)據(jù)分析

在EvaGreen digital PCR實驗中，只有一個熒光通道需要檢查，因此數(shù)據(jù)將被表示為一維點圖。其中每個點表示一個分區(qū)，y軸表示藍色檢測通道中各分區(qū)的熒光強度，x軸表示分析軟件分配給各分區(qū)的指標編號。

6.1數(shù)據(jù)質控

根據(jù)數(shù)據(jù)采集的類型，數(shù)據(jù)分析軟件可以提供不同的質量控制。應當仔細考慮兩項標準：

NTC：NTC只用陰性微滴

總微滴數(shù)：大量的可分析分區(qū)將減少與測量濃度相關的不確定性

在Naica 系統(tǒng)上，還可以可視化生成的分區(qū):

6.2閾值設置

通常，閾值是由分析軟件自動設置，閾值以上的分區(qū)為正，閾值以下的分區(qū)為負。因此，設置閾值是數(shù)字PCR對定量結果進行處理的一個強制性步驟。由于閾值設置是自動計算，我們建議您查看點一維圖。但是，下面兩種情況需要手動設置閾值：

●當有非常少的正分區(qū)或非常少的負分區(qū)時；

●當你觀察到正負分區(qū)之間有很多雨滴時。

6.3濃度計算

設置閾值后，軟件自動量化每個目標的正分區(qū)和負分區(qū)的數(shù)量。然后，使用泊松分布將這個數(shù)字讀數(shù)轉換為拷貝數(shù)。每個結果都有一個95%的置信區(qū)間，它反映了測量的精度。該方法的精度也可由 95%置信區(qū)間 值給出，越小越好!每個樣本濃度的95%置信區(qū)間及其相關的相對不確定度由分析軟件自動計算。如圖：

Evagreen數(shù)字PCR實驗具有設計簡單、條件建立快而且成本低等優(yōu)點，但是 由于DNA結合Evagreen為非特異性結合雙鏈DNA，所以Evagreen方法多用于低通量、單重實驗。

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