引言反相HPLC已成為分離和分析蛋白質(zhì)和多肽的重要工具。
它在生物技術(shù)行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類治療產(chǎn)品的表征，以及這些產(chǎn)品和雜質(zhì)的鑒定。
在通過(guò)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)之前，反相HPLC在從消化后的蛋白質(zhì)組中分離多肽方面有著至關(guān)重要的作用。
它也被用于探索性研究中多種蛋白質(zhì)和多肽的純化，以及蛋白類治療藥物的大規(guī)模純化。
反相HPLC靈敏、通用性強(qiáng)，還可與質(zhì)譜等技術(shù)結(jié)合使用，在蛋白質(zhì)研究中具有重要的地位。
此外，它還能夠分離結(jié)構(gòu)近乎相同的蛋白質(zhì)，因而得到了廣泛的應(yīng)用。
正如牛、人和豬胰島素變異體的分離過(guò)程所示（圖1），反相HPLC能夠分離非常相似的蛋白質(zhì)。
牛胰島素和人胰島素僅有三個(gè)氨基酸的差別，也能夠被完全分離開(kāi)來(lái)。
牛胰島素在胰島素 a 鏈的第8位為丙氨酸，第10位為纈氨酸， b 鏈的第30位為丙氨酸。
而人胰島素在胰島素 a 鏈的第8位為蘇氨酸，第10位為異亮氨酸， b 鏈的第30位為蘇氨酸。
圖1. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的胰島素變異體進(jìn)行分離
色譜柱：ACE 5 C18,4.6 x 250mm
洗脫液：含有29.3 - 31.7% 乙腈的 0.1% 三氟乙酸溶液，以1.0毫升/分鐘的速率洗脫至少16分鐘
樣品：牛、人和豬胰島素
 
豬胰島素和人胰島素僅有一個(gè)氨基酸的差異（豬胰島素的 b 鏈第30位為丙氨酸，人胰島素該位置為蘇氨酸），在基線即已分離。
在另一個(gè)實(shí)例中，盡管兔胰島素和人胰島素僅有一個(gè)氨基酸的差異，即以蘇氨酸取代了絲氨酸，但也同樣得到了分離（參考文獻(xiàn)1）。
反相HPLC的高分離能力也被擴(kuò)展應(yīng)用到了多肽上。
在圖2中，兩種多肽盡管只有一個(gè)氨基酸的差異，即絲氨酸對(duì)蘇氨酸，但也得到了完全的分離。
這種高分離能力是反相HPLC在蛋白質(zhì)和多肽分離中得到廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)性因素。
 
圖2. 以RP-HPLC對(duì)緊密關(guān)聯(lián)的多肽進(jìn)行分離。僅有一個(gè)氨基酸不同的兩種十肽菌素，一種含絲氨酸，而另一種含蘇氨酸。
蛋白質(zhì)/多肽的保留機(jī)制
在反相HPLC中，顆粒表面是十分疏水的，因?yàn)槠浔砻嫱ㄟ^(guò)化學(xué)連接有羥基（圖3中的波浪形紅線）。
通過(guò)疏水表面對(duì)蛋白質(zhì)一面（被稱為 疏水性足 ）的吸附，蛋白質(zhì)被保留下來(lái)（圖3）。
與疏水表面的厚度相比，蛋白質(zhì)要大得多，因此蛋白質(zhì)僅有一部分被疏水表面所吸附。
大部分蛋白質(zhì)位于表面上方并與流動(dòng)相接觸。
由這種疏水性吸附所導(dǎo)致的凈相互作用非常強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保持吸附在表面上（圖4A），直至接觸到特定濃度的有機(jī)溶劑，這時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)從表面上解吸附并從色譜柱上洗脫（圖4B）。
在最初的吸附/解吸附之后，盡管蛋白質(zhì)在從色譜柱上移動(dòng)下來(lái)時(shí)仍會(huì)與表面產(chǎn)生一些相互作用，但卻是十分微弱的，對(duì)分離過(guò)程無(wú)影響。
分離是由單次吸附/解吸附過(guò)程完成的。
解吸蛋白質(zhì)所需要的有機(jī)改性劑的濃度十分精確，并與疏水足的大小呈函數(shù)關(guān)系。
詳情請(qǐng)參閱參考文獻(xiàn)3。
圖4. 進(jìn)入色譜柱的蛋白質(zhì)被吸附在柱頂端附近的疏水表面上（A）并且一直保持吸附，直至有機(jī)改性劑的濃度達(dá)到特定值，此時(shí)蛋白質(zhì)從表面解吸附（B）。

在反相HPLC中，吸附/解吸保留機(jī)制導(dǎo)致蛋白質(zhì)的保留行為與小分子不同。
小分子的保留行為隨著有機(jī)溶劑濃度的改變而緩慢改變時(shí)（圖5，聯(lián)苯），一旦有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到所需要的值，蛋白質(zhì)的保留行為即發(fā)生突然改變，引起保留時(shí)間的快速變化（圖5，蛋白質(zhì)）。
該過(guò)程產(chǎn)生的尖銳峰形常見(jiàn)于蛋白質(zhì)和多肽（圖6A）。
由于有機(jī)溶劑濃度的微小變化會(huì)引起的顯著的保留行為變化，等度洗脫很少被用于蛋白質(zhì)中，因?yàn)榉遄儗捔?，而有機(jī)溶劑的微小改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保留行為的巨大變化（圖6B）。
圖5.有機(jī)溶劑濃度對(duì)應(yīng)的保留行為

圖6.
A. 梯度洗脫過(guò)程中多肽和蛋白質(zhì)洗脫出尖銳峰形。
B. 等度洗脫下，蛋白質(zhì)的峰形（本例中為溶菌酶）很寬，有機(jī)溶劑的微小改變都會(huì)引起保留時(shí)間的巨大變化。