低溫保護(hù)劑諸如二甲基亞砜（DMSO）、甘油和丙二醇等已經(jīng)被廣泛用于冷凍保存細(xì)胞和組織。DMSO是細(xì)胞保存中最常用的滲透型冷凍劑，但它對細(xì)胞也存在一定的毒性，常溫下能使胞內(nèi)蛋白變性。DMSO導(dǎo)致的不良反應(yīng)在動物實(shí)驗中已被證實(shí)。在一些臨床治療案例中，注射了含有DMSO的造血干細(xì)胞的病人表現(xiàn)出惡心、頭痛、高血壓、腹瀉和腹部絞痛等癥狀。因此 對于臨床治療的細(xì)胞保存應(yīng)該盡量減少DMSO的用量，或?qū)⑵涮鎿Q為一種更安全的冷凍保護(hù) 劑。

另一方面，隨著人們越來越關(guān)注DMSO對間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的效力及其分化潛力可能產(chǎn)生的損害，行業(yè)的技術(shù)人員們非常需要完全不含DMSO的無血清細(xì)胞冷凍保存溶液。

為了應(yīng)對目前全球細(xì)胞治療領(lǐng)域細(xì)胞凍存面臨的挑戰(zhàn)，全球領(lǐng)先的細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品和服務(wù)供應(yīng)商FUJIFILM Irvine scientific公司（富士膠片集團(tuán)成員）開發(fā)一系列cGMP級別的用于細(xì)胞治療的新一代無血清培養(yǎng)基，包括全球首個無動物源、化學(xué)成分明確的T細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，全球首個無動物源、化學(xué)成分明確的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，用于高效病毒載體制備的懸浮203無血清培養(yǎng)基等產(chǎn)品，值得注意的是，F(xiàn)UJIFILM Irvine Scientific公司還推出了一種新型的無動物源、化學(xué)成分明確的、無蛋白質(zhì)和無DMSO的細(xì)胞冷凍保存液，用于細(xì)胞的冷凍保存，該無血清細(xì)胞凍存液是cGMP級別，并已經(jīng)在FDA獲得了DMF，從而消除了使用中的監(jiān)管顧慮。

下面我們一起看一下FUJIFILM Irvine Scientific公司公開的無血清凍存液相關(guān)的測試數(shù)據(jù)。

在研究中，技術(shù)人員同時和傳統(tǒng)的DMSO冷凍保存溶液（含10％DMSO）進(jìn)行對比，證明了使用新型DMSO-Free 冷凍保存液（貨號 91149-10ml））對人脂肪來源、骨髓來源和臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSC，BM-MSC和UC- MSC）的良好效果。

方法

在細(xì)胞冷凍保存前和冷凍保存后，用PRIME-XV MSC Expansion XSFM培養(yǎng)基（FUJIFILM Irvine Scientific 公司的無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，貨號91149-250ml）擴(kuò)增三種主要的MSC細(xì)胞。在相同的細(xì)胞接種密度下，MSC細(xì)胞用PRIME-XV FreezIS（10％DMSO）和PRIME-XV FreezIS DMSO-Free兩種凍存液在液氮中冷凍2至5天。

存儲后，將MSC細(xì)胞解凍并連續(xù)傳代培養(yǎng)兩次，評估細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞活力、細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)和細(xì)胞的分化潛能。 用PerCP-Cy5.5偶聯(lián)的小鼠抗人CD45、APC偶聯(lián)的小鼠抗人CD90和PE偶聯(lián)的小鼠抗人CD105通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。在染色檢測前，MSC細(xì)胞分別在PRIME-XV成脂分化培養(yǎng)基中、PRIME-XV成骨分化培養(yǎng)基中和PRIMEXV 成軟骨分化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2到4周來確定其分化潛能。

結(jié)果

在細(xì)胞解凍24小時內(nèi)便可以觀察到初步的差異，在無DMSO溶液中冷凍保存的細(xì)胞質(zhì)量明顯更優(yōu)異。解凍后3天，在傳代之前，我們觀察到和預(yù)期MSC相當(dāng)?shù)乃芰腺N附能力和與成纖維細(xì)胞相似的形態(tài)（圖1）。

圖1: 在10％DMSO和無DMSO冷凍保存溶液中冷凍保存的MSC細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較。將人脂肪來源的MSC細(xì)胞在含有10％DMSO和不含DMSO的冷凍保存溶液中冷凍。 解凍后，細(xì)胞在PRIME-XV MSC培養(yǎng)基中擴(kuò)增。 觀察到細(xì)胞附著和細(xì)胞形態(tài)。 以10X放大率拍攝圖像。

10％DMSO和無DMSO冷凍的兩組MSC細(xì)胞解凍后，通過兩次傳代直至80％匯合時，活細(xì)胞計數(shù)是相當(dāng)?shù)模▓D2）。

 圖2: 在10％DMSO和無DMSO冷凍保存溶液中冷凍保存的MSC細(xì)胞擴(kuò)增比較。 解凍后，同時通過兩次傳代，人脂肪來源（AD-MSC）、骨髓來源（BM-MSC）和臍帶來源（UC-MSC）細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計。

所有MSC細(xì)胞都能夠在涂有纖連蛋白的組織培養(yǎng)塑料設(shè)備表面上增殖，沒有觀察到標(biāo)志物表達(dá)的差異。多次傳代的MSC細(xì)胞，維持CD105和CD90的陽性表達(dá)，CD45陰性（圖3）。

圖3: 多次傳代細(xì)胞維持MSC標(biāo)志物表達(dá)：CD105和CD90陽性，CD45陰性。 人脂肪來源的MSC細(xì)胞在PRIME-XV MSC Expansion XSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。

同時沒有觀察到冷凍保存溶液對細(xì)胞的影響。所有三種類型的MSC細(xì)胞都保留了多譜系分化潛能。細(xì)胞形成可見的脂質(zhì)空泡，呈現(xiàn)出典型的成脂分化。如預(yù)期的那樣，細(xì)胞還具繼續(xù)保持成骨分化能力。軟骨細(xì)胞球體的冷凍切片和染色證明了聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白的存在，這是典型的成軟骨分化（圖4）。

圖4: MSC細(xì)胞保留了多譜系分化潛力。 解凍后，將人脂肪來源的MSC細(xì)胞在PRIME-XV MSC Expansion XSFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 將MSC細(xì)胞分化成（A）脂肪細(xì)胞、（B）骨細(xì)胞和（C）軟骨細(xì)胞。 用（A）FABP-4（紅色），（B）OSTEOCALCIN（綠色）和RUNX2（紅色）和（C）AGGRECAN（紅色）和膠原II型（綠色）染細(xì)胞。 細(xì)胞核用DAPI（A和C）復(fù)染。

結(jié)論

該研究發(fā)現(xiàn)在冷凍保存之前和之后，細(xì)胞的性能是相當(dāng)?shù)摹?沒有觀察到細(xì)胞活力、CD105和CD90表達(dá)的有顯著性差異。 在無DMSO細(xì)胞凍存液中冷凍的MSC繼續(xù)能夠保持其分化潛能。

總體而言，該研究證明了FUJIFILM Irvine Scientific公司成功開發(fā)了一種新的可替代傳統(tǒng)含有DMSO冷凍保存環(huán)節(jié)的無血清細(xì)胞凍存液，該cGMP級別的凍存液具有無動物源、無蛋白、無DMSO的特點(diǎn)，從而可以盡量保證臨床應(yīng)用過程中細(xì)胞凍存環(huán)節(jié)的安全性，以更好地支持全球蓬勃發(fā)展的細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)。

如果您對FUJIFILM Irvine Scientific公司上市的無DMSO、無動物源、無蛋白、化學(xué)成分明確的細(xì)胞凍存液感興趣，或希望申請免費(fèi)測試樣品，可以發(fā)郵件至biopharma@irvinesci.cn進(jìn)行索取。

相關(guān)閱讀

新一代無血清細(xì)胞治療培養(yǎng)基的開發(fā)和應(yīng)用

全球首個無動物源、化學(xué)成分限定的NK細(xì)胞培養(yǎng)基上市

關(guān)于FUJIFILM Irvine Scientific

FUJIFILM Irvine Scientific是全球領(lǐng)先的專注于細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品創(chuàng)新研發(fā)和生產(chǎn)的高科技公司，在工業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)、輔助生殖、細(xì)胞治療和細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域，持續(xù)為全世界的科研、工業(yè)客戶及臨床醫(yī)生提供高質(zhì)量、可靠的產(chǎn)品和靈活、定制化的優(yōu)異服務(wù)。公司始終遵從國際ISO和FDA的嚴(yán)格監(jiān)管，并在美國加州和日本東京同時擁有國際一流的cGMP干粉培養(yǎng)基生產(chǎn)設(shè)施。

FUJIFILM Irvine Scientific公司長期以來堅持咨詢式服務(wù)的理念，憑借在全球細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品開發(fā)、服務(wù)領(lǐng)域及法規(guī)監(jiān)管、注冊合規(guī)方面的超過45年的經(jīng)驗和專長，得到了全世界客戶的認(rèn)可，并成為在培養(yǎng)基開發(fā)和服務(wù)領(lǐng)域全球戰(zhàn)略性的領(lǐng)導(dǎo)者。

FUJIFILM Irvine Scientific公司目前在全球生物制藥和細(xì)胞治療領(lǐng)域主要提供一系列cGMP級別的無血清培養(yǎng)基，包括CHO細(xì)胞新一代無血清、化學(xué)成分限定培養(yǎng)基和高效濃縮的補(bǔ)料、新一代懸浮293細(xì)胞培養(yǎng)基和CHO瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、定制化培養(yǎng)基開發(fā)和cGMP級別培養(yǎng)基干粉生產(chǎn)服務(wù)、新一代無血清、無動物源化學(xué)成分限定的T細(xì)胞培養(yǎng)基和NK細(xì)胞培養(yǎng)基、無血清無異源的干細(xì)胞培養(yǎng)基和無血清、化學(xué)成分限定的細(xì)胞凍存液等。