單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為我們理解復(fù)雜生命體中細(xì)胞的組成與各自功能及變化過(guò)程提供了強(qiáng)有力的工具?；趩渭?xì)胞基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們可以窺探發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控變化，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的各類(lèi)細(xì)胞及它們的細(xì)胞間交流，理解器官組織中復(fù)雜多樣的細(xì)胞類(lèi)型?，F(xiàn)有單細(xì)胞研究是一個(gè)從整體到個(gè)體，再由個(gè)體特征重建整體的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，有一些非常有意思的問(wèn)題是我們希望通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)加以理解的，比如，某個(gè)組織中，某類(lèi)細(xì)胞的發(fā)育生成過(guò)程；在不同條件下，細(xì)胞的改變過(guò)程和命運(yùn)等等。因此，我們需要通過(guò)特定的分析手段實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的分類(lèi)和還原，并通過(guò)數(shù)據(jù)來(lái)勾畫(huà)出細(xì)胞間的變化過(guò)程。在這樣的背景下，擬時(shí)間序列分析（Pseudotime分析）為我們提供了來(lái)解決該問(wèn)題的工具。
擬時(shí)間序列分析（Pseudotime分析）的字面意思是通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞間的變化軌跡來(lái)重塑細(xì)胞隨著時(shí)間的變化過(guò)程。從具體的分類(lèi)分析和復(fù)雜程度來(lái)說(shuō)，可以分為細(xì)胞軌跡分析和細(xì)胞譜系分析。
細(xì)胞軌跡分析指的是簡(jiǎn)單模型的細(xì)胞變化軌跡分析，通常指的是細(xì)胞沿著某個(gè)過(guò)程有特定化的變化終點(diǎn)，軌跡具有簡(jiǎn)單樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，一端是 根 ，另一端是 葉 ；細(xì)胞譜系分析通常指的是某類(lèi)祖源細(xì)胞，在特定條件下，有多個(gè)發(fā)育軌跡和命運(yùn)，變化過(guò)程類(lèi)似復(fù)雜樹(shù)狀分支變化過(guò)程。因此，簡(jiǎn)單細(xì)胞軌跡分析和細(xì)胞譜系分析原理上類(lèi)似，復(fù)雜程度有所區(qū)別，當(dāng)然，基于此的分析手法和方式也會(huì)有所不同。
近期單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也激起了基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析技術(shù)的爆發(fā)。從現(xiàn)有發(fā)表研究來(lái)看，已有不同類(lèi)型的分析方法用于擬時(shí)間序列分析。我們對(duì)現(xiàn)有常用的分析策略整理如下圖：
圖1 單細(xì)胞擬時(shí)間序列分析不同策略與流程 以下我們以Monocle軟件的擬時(shí)間分析為例，以簡(jiǎn)單模型來(lái)了解下通過(guò)該分析我們能拿到什么樣的結(jié)果。
擬時(shí)間序列分析包括基因選擇，數(shù)據(jù)降維和在擬時(shí)間內(nèi)排列細(xì)胞三個(gè)基本步驟：
1.選擇基因 
推斷單細(xì)胞軌跡是一個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)問(wèn)題。第一步是選擇機(jī)器學(xué)習(xí)方法輸入的基因。這叫做特征選擇，它對(duì)軌跡的形狀有很大的影響。算法通過(guò)檢查這些基因在細(xì)胞群中的表達(dá)模式來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序。尋找以 有趣 即不只是嘈雜方式變化的基因，并利用這些基因來(lái)構(gòu)造數(shù)據(jù)。這些基因?qū)a(chǎn)生一個(gè)健壯、準(zhǔn)確和具有生物學(xué)意義的軌跡。
2.數(shù)據(jù)降維
一旦細(xì)胞有序排列，我們就可以在降維空間中可視化軌跡，所以首先選擇用于細(xì)胞排序的基因，然后使用反向圖嵌入算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。
3.在擬時(shí)間內(nèi)排列細(xì)胞 
通過(guò)將表達(dá)數(shù)據(jù)投射到更低的維度空間，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)描述細(xì)胞如何從一種狀態(tài)過(guò)渡到另一種狀態(tài)的軌跡。假設(shè)軌跡具有樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，一端是 根 ，另一端是 葉 。盡可能地將最佳樹(shù)與數(shù)據(jù)匹配起來(lái)。這項(xiàng)任務(wù)被稱(chēng)為 歧管學(xué)習(xí) ，在生物過(guò)程的開(kāi)始階段，細(xì)胞從根部開(kāi)始，沿著主干前進(jìn)，直到到達(dá)第一個(gè)分支如果有的話。然后，細(xì)胞必須選擇一條路徑，沿著樹(shù)走得越來(lái)越遠(yuǎn)，直到到達(dá)一片葉子。一個(gè)細(xì)胞的偽時(shí)間值是它回到根的距離。
通過(guò)該過(guò)程，我們就能得到以不同分類(lèi)細(xì)胞為分類(lèi)的細(xì)胞軌跡圖：
圖2 細(xì)胞軌跡圖
  從上述的軌跡圖中，我們基本可以把這些細(xì)胞的軌跡途徑分為5個(gè)不同的階段（State），因此，可以用階段（State）對(duì)軌跡圖進(jìn)行繪制，以明確軌跡過(guò)程階段：

  圖3 細(xì)胞軌跡圖（按階段分類(lèi)）
  當(dāng)然，通過(guò)以上的分析結(jié)果，我們無(wú)法判斷出來(lái)軌跡的開(kāi)始，因此無(wú)法確定軌跡路線。所以，我們需要結(jié)合已有認(rèn)知，通過(guò)函數(shù)識(shí)別包含時(shí)間為零的大多數(shù)細(xì)胞的狀態(tài)，繪制擬時(shí)間軌跡圖： 圖4 擬時(shí)間軌跡圖 得到上述擬時(shí)間軌跡圖后，我們就可以根據(jù)不同的階段分類(lèi)，分別進(jìn)行分類(lèi)繪制，得到以下結(jié)果：
  圖5 State分類(lèi)細(xì)胞軌跡圖
  有了基本軌跡圖之后，我們可以用細(xì)胞差異基因排序得到的軌跡進(jìn)行驗(yàn)證?？梢钥吹?，差異基因排序產(chǎn)生的軌跡與以非監(jiān)督方法得到的軌跡非常相似，但它更 干凈一些 。 圖6 差異基因軌跡圖及非監(jiān)督聚類(lèi)軌跡圖
  接下來(lái)，根據(jù)不同細(xì)胞狀態(tài)，把不同的基因沿著不同的State分類(lèi)進(jìn)行作圖，以展示基因變化過(guò)程。 圖7差異基因各 State 表達(dá)散點(diǎn)圖 此外，根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型分類(lèi)，我們也可以將差異基因沿著擬時(shí)間軌跡繪制不同類(lèi)型細(xì)胞基因表達(dá)散點(diǎn)圖：
圖8差異基因擬時(shí)間表達(dá)軌跡圖
  最后，根據(jù)擬時(shí)間序列軌跡，我們把特征差異基因表達(dá)變化進(jìn)行聚類(lèi)，以熱圖形式展示基因的變化過(guò)程：
  圖9 差異基因聚類(lèi)熱圖 因此，通過(guò)擬時(shí)間序列分析，我們可實(shí)現(xiàn)構(gòu)建細(xì)胞變化軌跡途徑，并能找到特征差異基因的軌跡變化過(guò)程，這將為我們深入理解不同基因在某個(gè)細(xì)胞變化過(guò)程中的重要調(diào)控作用提供依據(jù)。
以上擬時(shí)間序列分析結(jié)果圖由上海生物芯片有限公公司生物信息學(xué)專(zhuān)家獨(dú)立完成，如有相關(guān)需求，請(qǐng)聯(lián)系上海生物芯片有限公司服務(wù)平臺(tái)。