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Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets

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https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.02.012

不知大家還記得否？去年小編曾報(bào)道了一篇Science的重磅文章，由來(lái)自德國(guó)馬普生物化學(xué)研究所Matthias Mann團(tuán)隊(duì)，利用磷酸化組發(fā)現(xiàn)了阿片類藥物副作用機(jī)制（最新Science重磅：磷酸化組學(xué)揭秘阿片類藥物副作用潛在機(jī)制）。

僅過半年多時(shí)間，該研究團(tuán)隊(duì)馬不停蹄地又發(fā)表了一篇力作。最近，該團(tuán)隊(duì)在Cell metabolism期刊上發(fā)表了題為 Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets 的研究，通過磷酸化蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，揭示GSK3-PDX1軸是胰島糖尿病致病關(guān)鍵信號(hào)節(jié)點(diǎn)。

可見，磷酸化修飾組已成為尋找醫(yī)藥研究領(lǐng)域機(jī)制探索的重要技術(shù)手段。

研究背景

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組以長(zhǎng)期高血糖為主要特征的代謝綜合征,伴隨很多合并癥和并發(fā)癥，其中90%是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)。2型糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，其發(fā)病機(jī)理為胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌缺陷，或胰島素分泌缺陷為主伴胰島素抵抗和肝臟葡萄糖產(chǎn)生增加。

越來(lái)越多的研究表明，胰島 細(xì)胞功能受損是2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。然而目前胰島 細(xì)胞功能紊亂具體分子機(jī)制仍不完全清楚。因此，系統(tǒng)性了解 細(xì)胞功能紊亂機(jī)制將有助于對(duì)于糖尿病的治療和預(yù)防。

此前，利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制已有諸多報(bào)道，但是從磷酸化角度發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)通路的報(bào)道卻不多。磷酸化是調(diào)控胰島分泌重要機(jī)制，因此，從整體磷酸化水平研究胰島素分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制有著十分重要的意義。

研究材料

正常小鼠（C57BLKS-Leprdb/+）和糖尿病小鼠（C57BLKS-Leprdb）胰島組織；

研究結(jié)果

01、磷酸化組、蛋白質(zhì)組

分析正常、糖尿病小鼠模型的蛋白修飾變化

研究人員首先對(duì)正常小鼠和糖尿病小鼠的胰島開展了label free蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的分析。結(jié)果共定量到6552個(gè)蛋白，超過14000個(gè)不同的磷酸化位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的PCA分析顯示，根據(jù)其不同糖尿病狀態(tài)明顯的將胰島分為兩群（圖1B、C）。在糖尿病組（db/db小鼠）中，上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)顯著富集于炎癥過程，而參與胰島素分泌的關(guān)鍵蛋白質(zhì)顯著下調(diào)表達(dá)（圖1D、E）。此外，db/db組幾乎所有mTOR/S6K底物磷酸化水平增加。

圖1. 研究技術(shù)路線

02、組學(xué)生信分析

發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠胰島中信號(hào)通路重構(gòu)

為了探討調(diào)控磷酸化蛋白質(zhì)組水平變化的機(jī)制，作者對(duì)db/db胰島中顯著變化的激酶底物motif進(jìn)行分析（圖2A）。結(jié)果顯示，與高營(yíng)養(yǎng)素誘導(dǎo)mTOR激活一致，p70S6K底物motif顯著富集，而AMPK motif下調(diào)表達(dá)。其他激酶motif，如ERK1/2和AKT同樣下調(diào)表達(dá)（圖2B）。此外，調(diào)節(jié)胰島素分泌包括PKA、PKC和CaMK幾種主要激酶的motif下調(diào)表達(dá)，該結(jié)果表明胰島 細(xì)胞在高葡萄糖誘導(dǎo)后不能正常分泌胰島素。

作者進(jìn)一步想了解在胰島細(xì)胞缺陷條件下信號(hào)通路如何整體重新布局。db/db胰島中PKA和PKC底物發(fā)生顯著的去磷酸化， 其催化底物的表達(dá)水平減少（圖2C）。糖尿病胰島中，高營(yíng)養(yǎng)水平誘導(dǎo)mTOR通路激活，進(jìn)而通過p70S6K-IRS1/2負(fù)反饋弧導(dǎo)致AKT抑制。AKT活性降低進(jìn)而引起其直接作用底物磷酸化水平的降低，GSK-3 是AKT的重要底物，其活性受AKT的負(fù)調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示，在db/db胰島中，GSK-3 的Ser9磷酸化抑制，同樣地GSK-3 的Tyr216的酪氨酸磷酸化水平顯著上調(diào)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)GSK-3 在糖尿病胰島中活性增加。PDX1 的是GSK3 和HIPK2直接作用底物，后者通過磷酸化Ser269可引起該蛋白進(jìn)行蛋白酶體降解。結(jié)果顯示，糖尿病胰島中，PDX1的Ser269的磷酸化水平上升，蛋白水平受影響，而其mRNA水平不受影響。結(jié)合文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在糖尿病胰島中信號(hào)傳導(dǎo)軸從mTOR通路激活開始，通過mTOR激活GSK3 ，PDX1降解。

圖2. db/db小鼠胰島中的關(guān)鍵信號(hào)通路被調(diào)節(jié)

03、挖掘致病關(guān)鍵信號(hào)軸

db/db胰島中PDX1（胰腺十二指腸同源框蛋白1）抑制使得GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子）下調(diào)表達(dá)以及抑制 細(xì)胞糖酵解

研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病組的胰島中GSK-3 激活，導(dǎo)致PDX1降解，這也確定了PDX1在 細(xì)胞生理學(xué)中的重要性。那么在 細(xì)胞中PDX1下游靶標(biāo)的表達(dá)是否同樣受到影響？結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，db/db胰島中所有PDX1的靶標(biāo)都顯著下調(diào)表達(dá)，其中GLUT2蛋白下調(diào)表達(dá)程度最大(圖3A)。GLUT2作為一種葡萄糖感受器，能夠有效調(diào)節(jié)血糖濃度，密切參與葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌。

此外，糖尿病胰島中參與糖酵解和TCA循環(huán)途徑的關(guān)鍵酶顯著下調(diào)表達(dá)，該變化從整體上影響了葡萄糖代謝（圖3B）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)幾乎所有呼吸酶的底物的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，降低的糖酵解代謝導(dǎo)致ATP/ADP濃度比降低，進(jìn)而可負(fù)反饋影響下游胰島素分泌機(jī)制。而對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析也表明許多參與胰島素細(xì)胞外分泌的蛋白顯著下調(diào)表達(dá)。

圖3. GLUT2抑制與糖酵解抑制相關(guān)

04、磷酸化組、蛋白質(zhì)組在人胰島中驗(yàn)證信號(hào)軸功能

糖毒性觸發(fā)GSK3依賴PDX1下調(diào)表達(dá)

在糖尿病過程中，不同的因素協(xié)同作用引起 細(xì)胞丟失和功能障礙。慢性或周期性暴露 細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致葡萄糖和脂質(zhì)或干擾 細(xì)胞功能促炎細(xì)胞因子水平提高。此外也有研究報(bào)道，GSK-3 可調(diào)控葡萄糖體內(nèi)平衡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也揭示了GSK-3 活化導(dǎo)致PDX1抑制，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病胰島中胰島素分泌機(jī)制損傷。因此，作者進(jìn)一步研究糖毒性是否可獨(dú)立觸發(fā) 細(xì)胞中GSK-3 激活，繼而導(dǎo)致PDX1轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶標(biāo)的降解。作者對(duì)三個(gè)不同志愿者胰島和INS1e大鼠 細(xì)胞分別給予高葡萄糖處理，隨后對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖4A）。結(jié)果顯示，在響應(yīng)慢性葡萄糖水平上升的過程中，一共約有7000個(gè)蛋白和19000磷酸化位點(diǎn)發(fā)生變化。

為了探討PI3K-AKT-GSK3以及其他關(guān)鍵信號(hào)通路激活狀態(tài)，通過組學(xué)數(shù)據(jù)以及結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人胰島和大鼠 細(xì)胞中，慢性高血糖癥導(dǎo)致GSK3激活。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)隨后GSK3的靶標(biāo)磷酸化水平提高，PDX1 的Ser268磷酸化水平上升，導(dǎo)致其降解（圖4B）。PDX1靶標(biāo)的表達(dá)水平，包括GLUT2和INS在db/db胰島中均下調(diào)表達(dá)（圖4C）。

后續(xù)作者進(jìn)一步驗(yàn)證GSK3在調(diào)控PDX1穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)GLUT2關(guān)鍵作用。首先，作者通過單獨(dú)或使用蛋白酶體抑制劑MG132, 通過抑制PI3K激活GSK3處理人胰島。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK3激活有效的導(dǎo)致PDX1降解和GLUT2抑制。更重要的是，GSK3激活的同時(shí)影響了葡萄糖誘導(dǎo)胰島素的分泌。那么抑制GSK3是否可改善糖尿病癥狀。作者通過使用GSK3抑制劑LY2090314處理肥胖小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該處理不僅恢復(fù)GLUT2和PDX1表達(dá)，同時(shí)完全恢復(fù)胰島分泌胰島素能力（圖4）。

圖4. 糖毒性誘導(dǎo)GSK3依賴PDX1下調(diào)表達(dá)

05、結(jié)論

作者通過基于質(zhì)譜的高通量磷酸化蛋白組、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，深入比較了正常和糖尿病小鼠胰島的磷酸化蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組信號(hào)網(wǎng)絡(luò)圖。 最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK3是胰島素分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)，抑制GSK3能恢復(fù)了糖尿病胰島分泌胰島素的能力。

小編總結(jié)

糖尿病是一類非常常見的代謝性疾病。雖然此前，關(guān)于糖尿病有大量組學(xué)報(bào)道的，包括利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)研究不同2型糖尿病動(dòng)物模型或人胰島，但是，這些研究主要是從參與 細(xì)胞損傷的差異基因或差異蛋白的角度進(jìn)行分析，但大規(guī)模分析該疾病的磷酸化信號(hào)網(wǎng)絡(luò)變化的研究卻甚少。

正是利用了更為新穎的修飾組學(xué)進(jìn)行研究，該文為我們呈現(xiàn)了一幅細(xì)致的糖尿病磷酸化網(wǎng)絡(luò)水平關(guān)鍵信號(hào)通路變化圖，并最終發(fā)現(xiàn)了胰島素分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)信號(hào)軸。因此，對(duì)于一些利用轉(zhuǎn)錄組等常規(guī)組學(xué)做的較為深入的疾病而言。我們不妨從更為新穎的修飾組學(xué)入手，去挖掘一些新的疾病致病機(jī)制。

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3. 合作文章發(fā)表：國(guó)內(nèi)率先+數(shù)量領(lǐng)先的磷酸化、泛素化組代表文章