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ACE HILIC色譜柱方法開發(fā)指南Ⅰ

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2019-04-27  來源:儀器信息網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):201

親水作用色譜(HILIC)采用與反相液相色譜(RPLC)類似的洗脫液,為親水性或極性到(至)極性很強(qiáng)的分析物提供了適宜的保留和分離替代方法(適宜的保留和分離提供了替代方法)。
RPLC的特征在于保留較少或無保留,所以這類親水性分析物(log P 值約為零或更小的那類分析物)的保留是一種挑戰(zhàn)(這些親水性的分析物(log P 值約為零或更小的那類分析物)的保留對(duì)于RPLC是一個(gè)挑戰(zhàn),因?yàn)橛梅聪嗌V方法這些分析物只具有很少的保留或者沒有保留)。

ACE HILIC色譜柱為親水性分析物提供了RPLC的替代選擇,無需使用諸如離子對(duì)試劑等添加劑。
多年來,比較常見的是采用高有機(jī)物含量的洗脫劑與水性組分結(jié)合使用(采用高有機(jī)含量的洗脫劑與水性組分結(jié)合是常見的HILIC方法),但HILIC一詞最早是在20世紀(jì)90年代[1]首次被提出用來代表極性分析物保留和分離所用的富含有機(jī)溶劑的洗脫劑(描述富含有機(jī)溶劑的洗脫劑用來保留和分離極性分析物)。

作為一種技術(shù),HILIC已經(jīng)應(yīng)用到了幾乎所有的色譜應(yīng)用領(lǐng)域,并且經(jīng)證明可有效用于臨床分析、食品和飲料應(yīng)用、以及制藥行業(yè)和蛋白質(zhì)組學(xué),這些領(lǐng)域中,極性到(至)極性很強(qiáng)的分析物的保留和分離仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

 

色譜法所用HILIC的主要優(yōu)勢(shì)

HILIC可對(duì)極性到極性很強(qiáng)的分析物進(jìn)行(提供)保留

作為一般的實(shí)用經(jīng)驗(yàn)法則,如果RPLC模式下分析物在咖啡因之前洗脫(log P~零(約為0)),則可能更適合HILIC分離模式。
如果RPLC模式下分析物在咖啡因之后洗脫,則更適合RPLC。
圖1示出了(表示)一種含有草甘膦(log P = -2.39)、咖啡因(log P = -0.13)和阿米替林(log P = 4.90)的混合物的RPLC梯度色譜圖。

圖1的頂部顯示的是一個(gè)近似值,HILIC和RPLC模式可在log P尺度內(nèi)運(yùn)行和重疊(顯示在Log P尺度下HILIC和RPLC模式操作和重疊的一個(gè)近似位置)。

很明顯,極性很強(qiáng)的分析物草甘膦會(huì)在RPLC模式下的柱頭塌陷附近洗脫,并且(表明)它非常適合HILIC。

RPLC模式可保留咖啡因(咖啡因可以使用RPLC模式),但也可使用HILIC。RPLC與HILIC之間的重疊區(qū)域常常會(huì)引發(fā)討論,因?yàn)閮煞N模式都具有優(yōu)勢(shì):選擇通常都是由應(yīng)用導(dǎo)向(已有應(yīng)用決定)。

阿米替林是最適合RPLC的疏水性分析物(疏水性分析物最適合用RPLC)。

如果分析物的log P特性未知,運(yùn)行在RPLC模式(如圖1所示)下的廣泛搜索梯度常??梢詭椭_定近似分析物的(的分析物)親水性/疏水性,同時(shí)可指示最適合的分離模式。

圖1
HILIC和RPLC操作范圍和重疊的實(shí)際演示
色譜柱:ACE 2 C18, 100 x 3.0 mm
流動(dòng)相:A = 10 mM 甲酸銨,pH 3.0 (aq) B = 10 mM 甲酸銨,pH 3.0 in MeCN:H2O (90:10 v/v)
梯度:5-100%B(10分鐘)
檢測:ELSD
流速:0.4 mL/min
溫度:30 C
進(jìn)樣:10 L
使用VWR-Hitachi進(jìn)行分析Chromaster(帶VWR ELSD90)

 

HILIC為RPLC提供了替代選擇

HILIC第二個(gè)優(yōu)勢(shì)特性在于:它通常能為RPLC提供互補(bǔ)或正交選擇,如圖2中所演示。

HILIC模式(圖2b)下,六種極性分析物的混合物的洗脫圖(洗脫情況)與采用RPLC分析的相同混合物正好相反,證明HILIC具有正交選擇性。

 

 

圖2
RP與HILIC之間的正交選擇性
(a)柱:ACE 5 C18, 150 x 4.6 mm
流動(dòng)相:0.1%醋酸(溶于乙腈/水中)(5:95 v/v)
(b)柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流動(dòng)相:0.1%醋酸(溶于乙腈/水中)(95:5 v/v)
流速:1 mL/min
溫度:22 C
檢測:UV, 254 nm
進(jìn)樣:5 L
樣品:
1) 胞嘧啶
2) 次黃嘌呤
3) 胸腺嘧啶
4) 可可堿
5) 茶堿
6) 咖啡因

選擇性是色譜分析中分析物析出(分辨率)的關(guān)鍵,因此可利用HILIC最大化極性到極性很強(qiáng)的分析物的選擇性(對(duì)于極性到強(qiáng)極性化合物,可利用HILIC最大化選擇性)。

在方法開發(fā)過程中,利用選擇性是了解分析物保留行為的第一步,同時(shí)也是增加觀察到樣本(樣品)內(nèi)所有種類可能性的一種有效工具。

不同且復(fù)雜的HILIC多模式保留機(jī)制為RPLC提供了一種理想的互補(bǔ)選擇性分離模式。

 

HILIC使用高有機(jī)物含量的洗脫劑

第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)源于HILIC模式下使用的高有機(jī)物含量的洗脫劑。

結(jié)果表明:與RPLC相比,其快速擴(kuò)散系數(shù)可達(dá)RPLC的兩倍,從而可強(qiáng)化傳質(zhì)和減輕C項(xiàng)對(duì)范第姆特方程(減小范特姆第方程C相) [2]的作用。

但是,HILIC中的流動(dòng)相必須包含至少3%的水性物質(zhì),以(因需)在固定相粒子周圍形成吸附水層以便分散開(分配)。非質(zhì)子有機(jī)溶劑乙腈通常用作HILIC中較弱的溶劑。

此外,HILIC洗脫劑對(duì)MS檢測[3]也有幫助。

有機(jī)溶劑含量非常高,可實(shí)現(xiàn)理想的低表面張力(高的有機(jī)溶劑含量可提供一個(gè)理想的低表面張力),并為MS源提供高揮發(fā)性的液體流,從而改善去溶劑化和離子形成的條件,因此增強(qiáng)
了信號(hào)響應(yīng)。

 

HILIC分離通??商峁┹^低的背壓

通常,HILIC模式下的色譜柱(和體系(系統(tǒng)))背壓比水-有機(jī)的RPLC洗脫劑更低(尤其是當(dāng)主要使用最常用的乙腈時(shí))。
這為色譜工作人員提供了一個(gè)選擇:在流速更高、甚至多組色譜柱結(jié)合(串聯(lián)使用)的情況下,都可以使用更小、更高效的粒子,增加了平板計(jì)數(shù)(理論塔板數(shù))或峰容量,同時(shí)背壓[4,5]也適度(在背壓合適的情況下,增加了平板計(jì)數(shù)(理論塔板數(shù))或峰容量 [4,5])。

 

色譜法所用HILIC的主要劣勢(shì)

HILIC法的穩(wěn)定性

這是一個(gè)經(jīng)常討論和報(bào)道的HILIC相關(guān)(與HILIC相關(guān)的)主題。

許多問題可以通過使用前足夠平衡的HILIC色譜柱的方式解決。

如果HILIC法包含一個(gè)梯度(梯度洗脫),那么進(jìn)樣之間也需要足夠的平衡。

 

樣本溶解性

由于其本身的性質(zhì),極性到極性很強(qiáng)的分析物很難溶解在有機(jī)物含量豐富的溶劑中并持續(xù)保持溶解狀態(tài)(在含有大量有機(jī)物的溶液中很難溶解以及保持溶解狀態(tài))。

 
關(guān)鍵詞: 極性 洗脫 分析 色譜 保留
 
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