什么時候需要緩沖溶液

在反相色譜分析中，流動相的pH值一般在2-7之間，當分析物在反相條件下可離解，或樣品的pH值在2－7之外時，就需要緩沖液，在反相條件下可離解的化合物一般有氨基和羧基，他們的pKa在1－11之間，選擇正確的緩沖液pH值可保證可離解的官能團處于一種形式，離子形式或中性化合物的形式；如果樣品的pH值對柱子有傷害，則緩沖溶液可使其變溫和或減小其危害，常規(guī)硅膠基質色譜柱的pH耐受范圍2-8。

如何選擇緩沖液pH值

在選擇緩沖液pH值之前，應先了解被分析物的pKa，高于或低于pKa兩個單位的值，有助于獲得良好的峰形，溶液PH值高于或低于兩個pKa兩個單位，化合物99％以一種形式存在。一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。

如何確定適當?shù)膒H適用范圍(僅適用于反向色譜法分析離子化合物方法開發(fā)中流動相pH的確定)

一.考察離子化合物的pKa值

在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻或者根據(jù)化合物的結構按照下圖中列出的主要酸堿官能團在水溶液的pKa值進行推測。

注意：按照上表中官能團進行估算時分子中相鄰基團的不同會導致pKa出現(xiàn)1-2個單位的差異。對于酸性化合物，當含有吸電子基團時會導致酸性增強，pKa值相應降低；對于堿性化合物，當含有吸電子基團時會導致堿性降低，pKa值相應降低。

二.根據(jù)化合物pKa值推測流動相相應使用的pH

先看下流動相pH對酸堿化合物的影響：

流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響

根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當流動相的pH約等于化合物的pKa時，可以最大限度的調整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度 2.5個單位的變動。但此時需要進行精確控制流動相的pH，這要求把流動相pH控制在0.02個單位以內，在實驗室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。

但我們實驗時可以將pH范圍放寬，只要將流動相pH控制在化合物pKa值 1.5個單位的范圍內（上圖所示的II范圍內）就可以對化合物保留行為產生比較明顯的影響，此時進行分離選擇性較好。同時為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在 0.1個單位以內(當流動相pH控制范圍較窄時建議使用緩沖鹽的質量進行控制，比pH計進行控制效果更優(yōu))。

通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關系。主要依據(jù)化合物出峰時間、化合物的峰型及所需要分離目標的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。

可能有人會發(fā)現(xiàn)第二點和第三點是有些矛盾的，這時候就需要對自己的實驗進行初步的探索，看看是否pH值會對化合物的峰型產生影響（有的專家認為該觀點缺乏理論和實踐的支持）或者是否需要準確調節(jié)pH在化合物pKa 1.5范圍內進行提高選擇性。

在做實驗時發(fā)現(xiàn)有的物質會因稀釋液pH使用不當產生峰分叉的現(xiàn)象，調節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時流動相pH在化合物的pKa 2的范圍內時離子化合物并沒有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。

三.根據(jù)流動相pH值測定所需要的緩沖鹽

1.緩沖液選擇主要依據(jù)：

（1）緩沖溶液的pKa和緩沖容量

（2）溶解度

（3）紫外吸收

2.對以上三點進行說明

(1)一般緩沖溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩沖能力最大，pKa與流動相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動相的pH與緩沖液的pKa值不能超過 1.0個單位，當緩沖溶液濃度較高時可以放寬范圍到1.5個單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見下圖：

緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol，因過低導致緩沖能力不足（可通過調整進樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過大會導致與有機相混溶時鹽的析出，對儀器、色譜柱都會產生損傷，而且使得基線不好。一般初始摸索方法時推薦使用25mmol。

（2）根據(jù)緩沖液溶解度：在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發(fā)現(xiàn)，當pH=7時10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機相的含量，在梯度洗脫時尤為注意）。

（3）根據(jù)化合物的吸收波長：在pH 3.5，6.0 pH 8.5或者pH 11.0磷酸鹽緩沖液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測波長。

3. 緩沖鹽的作用：

緩沖鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時間的穩(wěn)定性。

高效液相色譜法中選擇緩沖鹽的注意事項

在高效液相色譜法中，分離酸或堿緩沖溶液對維持流動相恒定pH和提高保留時間的重現(xiàn)性都非常重要。

怎么選擇緩沖液：

Pka和緩沖容量

溶解度

紫外吸光度（使用UV檢測器）

揮發(fā)性（MS蒸發(fā)光散射檢測器）

離子對性質

穩(wěn)定性和儀器的兼容性

根據(jù)以上的理論，流動相緩沖容量取決于緩沖鹽的pka，緩沖鹽濃度，流動相pH。

當緩沖液中溶質的的兩種形態(tài)（HA和 A-）濃度相等時，即緩沖鹽的pka與流動相pH相等時，緩沖能力最大。當流動相的pH與緩沖鹽的pka相差越大，緩沖鹽的緩沖容量就越小。因此緩沖的pka與流動相的pH相差不能超過 1.0個單位。

流動相的緩沖容量一般與緩沖液濃度成正比關系，通常濃度范圍為5~25mmol/l。

樣品溶解在流動相中可以避免在反相色譜過程中發(fā)生緩沖能力的問題，尤其是流動相緩沖液濃度較低或注入樣品量較大的時候尤為重要。

當緩沖容量偏低時，可以從以下方面調節(jié)緩沖容量：

1、減少緩沖液pKa與流動相pH之間的差異（可調節(jié)pH或更換緩沖液）

2、礦大流動相pH和溶質pKa之間的差異（當差異足夠大時，溶質倍完全離子化或者保持非離子化形式此時緩沖液顯的不重要了）

3、增加緩沖液濃度

4、減少樣品進樣體積

5、調節(jié)樣品的pH與流動相的一致。