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上海光學儀器廠，曾經(jīng)為發(fā)展民族工業(yè)，填補國內(nèi)空白，奠定了國家光學工業(yè)的系列化， 并先后與德國蔡司-歐波同（ZEISS-OPTON）、徠卡（LEICA）等國際著名光學公司合作生產(chǎn)各類精密光學儀器。

光學顯微鏡基礎(chǔ)知識 熒光顯微鏡

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熒光顯微鏡

顯微鏡的光學通路

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在熒光顯微鏡采用了汞或氙氣燈產(chǎn)生紫外線。光線進入顯微鏡并碰到分色鏡 一面鏡子，反映了一個波長范圍，并允許通過另一個范圍。分色鏡標本反映了紫外線。標本中的分子內(nèi)的紫外線激發(fā)熒光。物鏡收集熒光波長的光產(chǎn)生。這種熒光燈通過分色鏡和屏障過濾器（消除波長比熒光燈），使得它的目鏡，以形成圖像。

標本內(nèi)的熒光分子可以自然發(fā)生，或推出。例如，您可以與鈣黃綠素/ AM染料染色的細胞。就其本身而言，這種染料是沒有熒光。分子的AM部分隱藏的鈣黃綠素分子結(jié)合的鈣，這是熒光燈的一部分。當你混合的鈣黃綠素/ AM與洗澡細胞的解決方案，染料進入細胞穿過。活細胞的一種酶，消除了AM部分，陷阱細胞內(nèi)的鈣黃綠素和允許的鈣黃綠素結(jié)合鈣，所以它在紫外線照射下發(fā)出熒光綠色。死細胞，不再有這種酶。因此，活細胞熒光綠色，和死亡的細胞不會發(fā)出熒光。你可以看到在同一標本的死細胞，如果你在另一個稱為碘化丙啶染料，只滲透死細胞混合。碘化丙啶結(jié)合到DNA在細胞核和紅色熒光紫外線照射下。這雙染技術(shù)在毒理學研究中使用，以確定一些環(huán)境化學處理，如農(nóng)藥，被殺害，當一個細胞人口的百分之。

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培養(yǎng)的大鼠腦細胞的熒光圖像。活細胞染色與鈣黃綠素（左）和死細胞染色，碘化丙啶（右）。

熒光顯微鏡技術(shù)，看到結(jié)構(gòu)和測量在活細胞中的生理生化事件。各種熒光指標是可以研究許多重要生理作用的化學物質(zhì)，如DNA，鈣，鎂，鈉，pH值和酶。此外，特有的各種生物分子的抗體，可以通過化學方法綁定到熒光分子和用于染色細胞內(nèi)特定的結(jié)構(gòu)。分子表達式：熒光顯微鏡的詳細信息和更多的例子。

在下一節(jié)，我們將研究光學顯微鏡及其功能的組件。

熒光燈:一種光學熒光顯微鏡物鏡是用來把重點放在試樣紫外線和搜集標本的熒光燈。比傳輸熒光，其中一個單獨的鏡頭或冷凝器是把重點放在試樣紫外線更有效。還允許另一種類型在同一顯微鏡結(jié)合熒光顯微鏡。

光學顯微鏡基礎(chǔ)知識 光學顯微鏡的組成部件

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無論是一個簡單的學生顯微鏡或一個復(fù)雜的研究顯微鏡，光學顯微鏡具有以下基本制度：

控制標本 保存和操作試樣階段 試樣在于剪輯 舉行試樣階段（還是因為你是在尋找一個放大的圖像，甚至試樣的最小變動可以將圖像的某些部分出 你的視野）顯微設(shè)備，讓您移動控制，沿X和Y軸的小增量的標本（用于掃描幻燈片）

照明 闡明標本（最簡單的照明系統(tǒng)，是一面鏡子，反映室內(nèi)光線通過標本。）燈 產(chǎn)生光（通常情況下，燈鎢燈絲燈泡專門的應(yīng)用，汞或氙氣燈。變阻器。用來產(chǎn)生紫外線，甚至有些顯微鏡使用激光掃描標本） 改變燈控制產(chǎn)生的光冷凝器的強度的電流 鏡頭系統(tǒng)將集中到燈的光標本隔膜或針孔孔徑 放置在光路改變的光量，到達冷凝器（圖像增強反差）一個典型的學生光鏡下圖，顯示的部件和光路

鏡頭 形成圖像物鏡 集光從標本目鏡 傳輸和放大的圖像從物鏡到你的眼睛物鏡轉(zhuǎn)換器 旋轉(zhuǎn)貼裝，擁有許多物鏡管 保存在適當?shù)木嚯x物鏡，目鏡，阻擋了雜散光

焦點 在適當?shù)木嚯x從標本粗調(diào)焦旋鈕的位置物鏡 用來將進入精細調(diào)焦旋鈕物鏡焦平面的對象 用來進行微調(diào)聚焦影像

支持和對齊ARM 彎曲部分保存在一個固定的距離光學部件，并將他們的基地 支持顯微鏡部件機架和小齒輪的方式管連接顯微鏡臂的重量。這個系統(tǒng)可讓您更換鏡頭或觀察員時，移動鏡頭遠離舞臺變化的標本時，對焦圖像。

上面提到的一些部件圖所示差異顯微鏡。顯微鏡來在兩個基本配置：一身正氣，倒。在圖中顯示的顯微鏡是一個堂堂正正的顯微鏡，它具有以下的階段，在舞臺上空的鏡頭系統(tǒng)，照明系統(tǒng)。倒置顯微鏡，舞臺上方的照明系統(tǒng)和臺下的鏡頭系統(tǒng)。通過厚的標本，如培養(yǎng)細胞的菜肴，是因為鏡片上可以得到接近底部的菜，細胞生長，倒置顯微鏡更好。

光學顯微鏡可以揭示活細胞和組織結(jié)構(gòu)，以及非生物樣本，如巖石和半導體。顯微鏡，可以簡單或復(fù)雜的設(shè)計，和一些可以做多個類型的顯微鏡，其中每個顯示略有不同的信息。光鏡下極大地推進我們的生物醫(yī)學知識，并繼續(xù)成為一個科學家的強大工具。

光學顯微鏡基礎(chǔ)知識 光學顯微術(shù)的種類

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在顯微鏡下觀察標本的一個主要問題是自己的形象沒有太大的反差。這是生活的東西（如細胞）尤其如此，盡管天然色素，如綠葉，可以提供良好的對比度。提高對比度的方法之一是治療用彩色顏料或染料結(jié)合特定結(jié)構(gòu)的標本的標本。已經(jīng)開發(fā)了不同類型的顯微鏡，以改善在標本的對比。該專業(yè)主要是在照明系統(tǒng)和標本通過光的類型。例如，暗視野顯微鏡使用一種特殊的冷凝器來阻擋最明亮的光線和斜光照亮標本，很像月球塊從日食的太陽光線。這種光的設(shè)置提供了一個完全黑暗的背景，提高形象，帶出精致的細節(jié)對比 在明亮的區(qū)域界限內(nèi)標本。

圖:一個相襯顯微鏡的光路設(shè)計

下面是光學顯微鏡技術(shù)的種類：

明視場,明場 這是基本的顯微鏡配置（迄今看到的圖像是從明場顯微鏡）。這種技術(shù)已經(jīng)非常小的反差;到目前為止，你看到的圖像，對比度已被染色的標本提供。

暗視場/暗場 此配置提高對比度，如上所述。分子表達式：暗場顯微鏡的細節(jié)和例子。

萊茵照明 這個設(shè)置是類似暗場，但使用了一系列的過濾器產(chǎn)生的 光染色 的標本。分子表達式：萊茵照明細節(jié)和例子。

以下技術(shù)作為萊茵照明使用相同的基本原則，實現(xiàn)不同的結(jié)果，使用不同的光學元件。其基本思路包括分裂成兩個途徑的光束，照亮標本。內(nèi)通過試樣，通過密集結(jié)構(gòu)的光波減慢，相比那些通過較密集的結(jié)構(gòu)傳遞。由于所有光波的收集和傳輸?shù)侥跨R，他們重組，使他們互相干擾。干擾模式提供了對比：他們可能會顯示淺色背景的暗區(qū)（更加密集）（密度較?。?，或創(chuàng)建一個虛假的三維（3 D）圖像類型。

相襯 這種技術(shù)是最好的活標本，如培養(yǎng)細胞。

在相差顯微鏡，物鏡和聚光環(huán)環(huán)單獨的光線。的光，通過光路的中央部分，通過重組與光試樣的邊緣周圍旅行。這兩條路徑產(chǎn)生的干擾會產(chǎn)生致密的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在其中比背景暗的圖像。分子表達式：相顯微鏡細節(jié)和例子。

微分干涉對比（DIC） DIC的使用偏光濾鏡和棱鏡的光路分離和重組，讓一個3 D的外觀標本（DIC是后該名男子是誰發(fā)明了它也被稱為Nomarski）。分子表達式：微分干涉對比顯微鏡細節(jié)和例子。

霍夫曼調(diào)制的對比 霍夫曼調(diào)制對比的是類似于DIC的，除非它使用小狹縫板在軸和離軸光路產(chǎn)生兩套光波穿過標本。同樣，一個3 D圖像形成。分子表達式：霍夫曼調(diào)制相差顯微鏡細節(jié)和例子。

偏振 偏振光光鏡下使用兩個偏振片，標本兩側(cè)，垂直于對方，所以，唯一的光線通過標本通過到達目鏡。燈是在一個平面偏振光，它穿過第一個過濾器，達到標本。定期間距，圖案或試樣的結(jié)晶部分旋轉(zhuǎn)的光線穿過。通過第二個偏光鏡通過這個旋轉(zhuǎn)燈，使這些規(guī)則排列的領(lǐng)域顯示明亮的黑色背景。分子表達式：偏光光學顯微鏡的細節(jié)和例子。

熒光 這種類型的顯微鏡使用高能量，短的波長的光（通常是紫外線）激發(fā)標本內(nèi)的某些分子內(nèi)的電子，導致這些電子轉(zhuǎn)移到更高的軌道。當他們回落到原來的能量水平，他們發(fā)出能量較低，波長較長的光（通常是在可見光譜），從而形成圖像。

在下一節(jié)，我們將討論更詳細的熒光顯微鏡。

試樣制備

透射光觀察標本時，光線必須穿過標本，以形成一個圖像。試樣較厚，光線穿過。穿過的光線就越少，圖像越暗。因此，標本必須?。?.1至0.5毫米）。許多活標本必須切成薄片前觀察。標本的巖石或半導體太厚切片和透射光觀察，所以他們反映其表面的光線觀察。

光學顯微鏡基礎(chǔ)知識 圖像質(zhì)量

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當您在使用顯微鏡標本的時候，你看到的圖像質(zhì)量評估情況如下：

花粉粒的圖像亮度好（左）和亮度較差（右）

亮度 亮或暗的形象如何？亮度是相關(guān)的照明系統(tǒng)，可通過改變電壓的燈（變阻器）和調(diào)整冷凝器和隔膜/針孔光圈改變。亮度也與數(shù)值孔徑的物鏡（數(shù)值孔徑較大，則圖像越亮）。

 

花粉粒圖片對焦（左）和重點（右）

焦點 圖像模糊或明確界定的？重點是與焦距和重點旋鈕可以控制。標本幻燈片上的玻璃蓋的厚度也可以影響你的能力為重點的形象 它可以是過于厚物鏡。物鏡側(cè)面寫上正確的蓋板玻璃厚度。

具有良好的分辨率（左）和分辨率較差（右）的花粉粒圖像

分辨率 如何關(guān)閉可以在圖像中的兩個點才不再作為兩個獨立的點呢？分辨率與數(shù)值孔徑的物鏡（數(shù)值孔徑更高，更好的分辨率）和波長的光線通過鏡頭（波長越短，分辨率越好）。

花粉粒具有良好的對比（左）和對比度差的圖像（右）

對比度 照明標本鄰近地區(qū)之間的差異是什么？對比相關(guān)的照明系統(tǒng)，可通過改變光的強度和隔膜/針孔光圈調(diào)整。此外，適用于試樣的化學污漬可以增強對比度。

在下一節(jié)，我們將討論不同類型的顯微鏡。

光學顯微鏡基礎(chǔ)知識 工作原理

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自從他們在16世紀后期的發(fā)明，光學顯微鏡，加強在基礎(chǔ)生物學，生物醫(yī)學研究，醫(yī)療診斷和材料科學的知識。光學顯微鏡可觀察放大高達1000倍的物體，揭示了微觀細節(jié)。光顯微鏡技術(shù)的發(fā)展遠遠超出羅伯特胡克和安東尼范列文虎克的第一顯微鏡。已經(jīng)開發(fā)了特殊的技術(shù)和光學揭示活細胞的結(jié)構(gòu)和生物化學。顯微鏡甚至已經(jīng)進入數(shù)字化時代，利用電荷耦合器件（CCD）和數(shù)碼相機捕獲圖像。然而，這些先進的顯微鏡的基本原則是很多像你可能已經(jīng)在你的第一個生物課的學生顯微鏡。

在本文中，我們將進入光學顯微鏡的微小世界和檢查，讓他們暴露是什么，否則無法檢測到人眼的各種技術(shù)。

基礎(chǔ)知識

光學顯微鏡的工作方式非常像折射望遠鏡，但一些細微的差別。讓我們簡要回顧望遠鏡是如何工作的。

望遠鏡必須收集大量光線昏暗，遠處的物體，因此，它需要一個大的物鏡收集盡可能多的光，并把它帶到光明的重點。由于物鏡是大的，它帶來的一個重點對象的形象，在一定的距離，這是為什么望遠鏡更長的時間比顯微鏡。望遠鏡的目鏡放大，圖像，因為它帶給你的眼睛。

相比之下望遠鏡，顯微鏡必須收集從薄，以及照明的標本，是密切由微小的面積。因此，在顯微鏡并不需要一個大的物鏡。相反，在顯微鏡的物鏡，小球形，這意味著它兩邊的焦距要短得多。它使人們集中在一個短的距離內(nèi)，在顯微鏡的管對象的形象。圖像放大，第二個鏡頭，稱為目鏡或目鏡，因為它是你的眼睛。

其他望遠鏡和顯微鏡之間的主要區(qū)別在于，，顯微鏡有一個光源和一個冷凝器。冷凝器是一個鏡頭系統(tǒng)，著重從源到一個微小的，亮點的標本，這是同一地區(qū)的物鏡檢查。

也不像其中有一個固定的物鏡和互換目鏡，望遠鏡，顯微鏡通常有可互換物鏡和固定目鏡。通過改變物鏡（相對平坦，低倍率的目標要全才，高倍率的目標），顯微鏡可以帶來越來越小的領(lǐng)域，進入視野 聚光的首要任務(wù)，因為它不是在顯微鏡的物鏡，望遠鏡的。

我們將在本文后面，在顯微鏡的部分詳細介紹。

做一個簡單的顯微鏡

您可以通過一個簡單的顯微鏡下，用放大鏡和紙張：

獲得兩個放大鏡和一張印刷紙。

保持一個放大鏡以上紙張的短距離。打印圖像會顯得更大一點點。

將你的眼睛和放大鏡之間的第二個放大鏡。

移動第二個玻璃或打印，直到成為大家關(guān)注的焦點。你會發(fā)現(xiàn)，打印出現(xiàn)大于它在第一放大鏡。

光學顯微鏡對比

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當成像標本，在光學顯微鏡下，在強度和/或顏色差異造成圖像對比度，這使得個人的特點和標本的細節(jié)變得可見。對比度定義為光照強度之間的形象和相鄰的背景，相對的整體背景強度的差異。在一般情況下，最低為0.02（2％）的對比度值是需要由人眼分辨的圖像和它的背景之間的差異。對于其他探測器，如電影，視頻攝像機，或光電探測器（CCD和CMOS器件），最低的反差往往是一個不同的值。每個探測器，信號信噪比（噪音是所有的光在光學系統(tǒng)沒有圖像信息的）必須大到足以形成一個連貫的圖像的解釋。

標本中產(chǎn)生的光的吸收的對比度，亮度，反射，雙折射，光散射，衍射，熒光或顏色的變化已經(jīng)在明顯微鏡的成像標本的古典意味。映襯或其他鄰近的細節(jié)一個細節(jié)的能力是衡量標本的對比。在一個簡單的公式，對比度可以被描述為：

Percent Contrast (C) = ((I(s) I(b)) 100)/I(b)

I（b）為背景的強度，I（S）是試樣的強度。從這個等式，這是顯而易見的標本對比度是指圖像中的最高和最低的強度之間的關(guān)系。在圖1所示的圖表顯示的背景強度上的對比效果。當背景是一個非常暗灰色（I（B）等于0.01），在圖像強度小的變化，產(chǎn)生一個大的變化相反。通過減輕的背景顏色有點淺灰色（I（B）等于0.10），在圖像亮度的微小變化，提供一個有用的對比。在較亮的背景顏色（一（b） 0.20），圖像對比度是相對不敏感的背景強度，并在我大的變化（二）只產(chǎn)生小的增加或減少圖像對比度。

雖然在現(xiàn)代顯微鏡發(fā)現(xiàn)的光學系統(tǒng)可能生產(chǎn)在高放大倍率的高分辨率圖像的能力，這種能力是沒有足夠的對比度在圖像毫無價值。對比度是不是一個試樣的固有財產(chǎn)，但依賴于光耦合到探測器可靠地記錄圖像信息的能力的光學系統(tǒng)的效率與試樣相互作用。顯微鏡的光學系統(tǒng)中的圖像對比度控制，取決于幾個因素，主要是設(shè)置光圈隔膜，在光學系統(tǒng)的像差程度，光學對比系統(tǒng)，標本類型，和光探測器。在顯微鏡有幾個網(wǎng)站，讓對比度調(diào)整。這些領(lǐng)域的光圈，冷凝器光圈，視頻檢測器的進一步放大，電子照相機伽瑪，電影伽瑪，印刷紙伽瑪，在實時圖像處理，以及標本染色。

因為人眼感知自己的形象產(chǎn)生了對比的對象，可以很容易誤入歧途，除非有知識的光學事件發(fā)生產(chǎn)生圖像的對比度。圖2說明了三個相同的視場，含無色透明，人類面頰細胞與不同的對比度模式下的光學顯微鏡成像顯微照片：明，相襯，霍夫曼調(diào)制對比度。這是很明顯的，出現(xiàn)不同的三個圖像，以及由于這些變化，顯微鏡可能到達每個視場從不同的結(jié)論。在圖2（a）所示的細胞成像與顯微鏡操作與冷凝器的光圈在明模式，關(guān)閉足以使試樣邊緣可見。

使用相襯光學面頰細胞相同的視場是在圖2（b）所示。注意：黑暗的內(nèi)心地區(qū)和周圍的細胞膜和細胞核（所謂的光暈，是文物）如物體的邊緣明亮的外地區(qū)。這種觀點認為，這是困難的指定單元格的邊緣，并解釋圖像中的黑暗與光明的地區(qū)的原因。這些細胞也出現(xiàn)相當平坦。最后，在圖2（c）所示的細胞成像使用霍夫曼調(diào)制對比度，圖像的一面是黑暗的，而它的對面是光明的，導致偽三維物體的感知。在圖2中，每個視場提供了不同的標本形象，并導致不同的解釋，只能顯微鏡有關(guān)如何創(chuàng)建這些圖像與知識破譯。

在光學顯微鏡，尤其是未染色或物質(zhì)生活的許多標本，反差如此之差，該標本仍然基本上是無形的客觀能力解決或明確分開的細節(jié)。通常情況下，只等標本，重要的是不要改變他們殺害或化學染料或固定劑治療。這種必要性已導致顯微鏡，企圖以提高試樣的知名度并沒有改變試樣本身帶來更詳細的圖像對比度增強了一百多年的技術(shù)實驗。它是一種常見的做法，以減少冷凝器光圈下面推薦的大小或降低顯微鏡臺下聚光器，以提高標本的對比。不幸的是，雖然這些演習確實會增加對比度，他們也嚴重降低分辨率和清晰度。

它之前要考慮如何光與物質(zhì)相互作用的特點，討論在光鏡下控制對比度的方法是有用的?？赡苁强臻g相干，語無倫次，或部分相干光照亮標本負責。例如，可以形光束狹縫或環(huán)的形式，可以選定的波長，在各個方向振動垂直傳播或在一個單一的方向，由于兩極分化的方向組成。

一些標本被認為是振幅的對象，因為它們吸收光線，部分或完全，因此可以很容易使用傳統(tǒng)的明視野顯微鏡觀察。其他自然顏色或人工與化學顏色染料染色，也可清楚地用顯微鏡成像。這些污漬或自然的色彩吸收，白色光通過的某些部分和傳輸或反映其他顏色。通常情況下，污漬相結(jié)合，產(chǎn)生的對比色，如藍色蘇木結(jié)合細胞質(zhì)中的粉紅色曙紅細胞核染色。它是一種常見的做法，利用標本，不容易吸收光線的污漬，從而使眼可見的圖像。

其他標本不吸收光線，被稱為相位對象。由于人的眼睛只能檢測亮度和顏色的差異，相位的變化由于對象必須被轉(zhuǎn)換成強度的差異。階段標本的特點是幾個標準，包括其形狀（通常為圓形或扁），內(nèi)部光散射元素的密度，厚度，以及獨特的化學或電氣（統(tǒng)稱為折射率分組）的結(jié)構(gòu)特性。厚標本可能是比較明確的，只包含一些光散射元素，或不通過光線，使試樣的有效不透明傳輸照明，它們可能包含很多散射元素。這些標本通常被稱為反射光標本。

當考慮的光學方法，以提高標本的對比，這是一個可以操縱的這些特性創(chuàng)造的強度變化，使它們可見的標本中有必要考慮各種特性。一個首要的問題是其中的對象的特點，將獨特的設(shè)置在很多情況下轉(zhuǎn)化成不同的強度。

標本的細節(jié)和邊緣，有大小近似將衍射成像光的波長或散射光線，提供有一個之間的標本及其周圍介質(zhì)（環(huán)繞聲）的折射率的差異。折射率的定義是通過空氣或真空中光的速度通過??對象分為光的速度比。因為光的速度通過??任何材料是小于光在真空中的速度，折射率總是超過1.0用顯微鏡檢查標本價值。為了解決小對象之間的距離，并重現(xiàn)其形狀與合理的保真度，大角度的衍射光必須被捕獲顯微鏡物鏡。

衍射（或背離）光聚集的目標，必須帶入一個大家關(guān)注的焦點，在平面圖像，以產(chǎn)生標本細節(jié)，如在圖3所示。在圖像平面，組成衍射光的光波經(jīng)過undiffracted光線的干擾。干擾后的能見度非常依賴一致性照亮標本后，能見度增加按比例增加的一致性。在光學顯微鏡下，冷凝器的光圈開口大小控制的空間相干光對試樣的沖擊。減小光圈大小，產(chǎn)生一個更大的空間相干性。

顯微鏡長期以來依靠降低冷凝器光圈開口尺寸增加階段標本中的顆粒和邊緣的能見度。振幅對象的對比也可以提高冷凝器的孔徑適當?shù)恼{(diào)整。小的物體，邊緣和粒子將衍射光，不管他們是否屬于一個幅度或相位標本。只有這種衍射光的一部分被捕獲的目標（見圖3）由于客觀的數(shù)值孔徑的限制。剩余不收集的衍射光圖像信息丟失。冷凝器光圈開口尺寸正確的設(shè)置是一個標本圖像對比度增強和引進衍射文物之間的權(quán)衡。這些都表現(xiàn)在虧損的分辨率，衍射環(huán)的疊加，和其他不良的光學效應(yīng)的標本中，在共同關(guān)注的焦點的地區(qū)。由于接近衍射極限，圖像對比度降低對象的詳細信息變得越來越小，空間頻率變大。

井上和彈簧所描述的圖像對比度的比值標本的對比，并在實際和理想化的光學傳遞函數(shù)（OTF）當空間頻率的函數(shù)繪制的正弦形象占領(lǐng)的陣地相移。光從標本中的分布變得正弦的情況下，光學傳遞函數(shù)模成為調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）。隨著空間頻率的增加，調(diào)制傳遞函數(shù)的減少和標本的對比減少。

對于每一個目標，具體的調(diào)制傳遞函數(shù)依賴的目標設(shè)計和數(shù)值孔徑，對比一代的模式，照明光的波長，和臺下冷凝器的數(shù)值孔徑。作為一個低通濾波器的衍射光，必須在平面圖像干擾，集中發(fā)生和形成的顆?；蜻吘壍男蜗蟮哪繕撕蠼蛊矫娴倪吘?。聚焦顯微鏡將這些衍射光波在中間的平面圖像。光的波前與標本的角度，決定集中的頂部或底部光滑圓潤的表面，通常不包含衍射網(wǎng)站的困難程度。但是，球形標本或纖維的邊緣很容易集中，因為邊緣接口是在波前有足夠的角度和衍射光。

在討論階段標本時，我們將定義一個對象的任何標本的解析部分。許多對象將持平或片狀，如圖4所示。在這個數(shù)字中，對象有一個厚度（T），折射率，N（S）。周圍介質(zhì)的折射率為n（M）。

標本通過光路的光傳播，OP = T（N（S）），并通過光路周圍介質(zhì)，OP = T（N（M））。光程差（OPD）可以表示為：

OPD = (tn(s) tn(m)) = t(n(s) n(m))

隨著相位差：

= (2 / )(OPD)

其中 是一個常數(shù)（3.14159265）， 是波長照亮標本。光程差的產(chǎn)品兩個方面：厚度（T）和折射率（n）的區(qū)別。在門診經(jīng)?？梢韵喈敶?，即使對象的厚度相當薄。另一方面，當標本和周圍介質(zhì)的折射率是平等的，門診是零，即使試樣的厚度是非常大的的。在這種情況下，光線穿過對象僅僅是延遲（相位差）相對的光線環(huán)繞同等厚度。相位差是無法檢測到人眼。

相襯顯微鏡的設(shè)計，采取的一個標本，并在周圍介質(zhì)中的對象之間的相位差優(yōu)勢。但是，它不只是一個階段的差異，是必要的，但也從試樣的衍射必須發(fā)生相襯顯微鏡工作。

一個階段的對象，最常見的形狀是一個不斷變化的，如在圖5所示的半球形標本，光路或密度。在這種情況下，雙方相對象可以由棱鏡的形狀近似數(shù)學，討論如下。在圖5的階段對象的折射率N（S）和周圍介質(zhì)中，N（M）。相對象的形狀激進的幾何轉(zhuǎn)換只發(fā)生在邊緣A和B（見圖5（a）條）。入射光的影響對象垂直于AB的平面，而平面波前是平行于AB。

1（在圖5（a）四舍五入階段對象的頂點）的邊界基本上是平行的事件眼波的，而在A和B的界限是垂直的。 2至4個區(qū)域是由相對象（圖5（b））的圓形表面的切線定義的微型棱鏡。 棱鏡 的角度在區(qū)域2比4地區(qū)，這是相反的區(qū)域4 較小。在邊緣A和B的衍射是最強的。

因此，彎曲的物體組成的多棱鏡和兩側(cè)的對象棱鏡面向相反的方向。最陡的棱鏡是在赤道的一個球形的對象，而在位于頂部和底部的坡度用最少的棱鏡。這些微型棱鏡構(gòu)成的光學梯度：

OG (Optical Gradient) = = (n(s) n(m))

其中， 的切線與平面波前角。請注意，光學梯度是產(chǎn)品兩個方面：光通過雙方之間的角度（ ），折射率（N（S） N（M））的區(qū)別。光線通過棱鏡改變方向傳遞的角度 （參見圖5（c）和5（D））。方向的變化可能會很大，即使斜坡或邊界梯度的可能很小，如果折射率相差較大。如果是相同的折射率，光波通過第一階段對象unrefracted。退出棱鏡光的方向依賴于相對象（N（S））和其周圍介質(zhì)（N（M），參見圖5（c）和5（D））之間的折射率的相對差異。

正如我們上面所討論的，圓潤的階段對象不斷變化的光梯度，以及每一個人的光學梯度 棱鏡 創(chuàng)建一個光偏轉(zhuǎn)的角度不同。圖5（c）說明了當周圍介質(zhì)的折射率大于相對象（N（M）N（S）），和圖5（d）時顯示的方向卻是相反的方向偏轉(zhuǎn)（ N（M） N（S））。偏轉(zhuǎn)角， ，是成正比的切線角（ ）和折射率差（N（S） N（M）），這樣：

tan = tan (n(s) n(m))

對于小角度：

= (n(s) n(m)) (in radians)

要總結(jié)的 棱鏡 效應(yīng)的光學梯度界限，當超過周圍介質(zhì)的折射率相對象，每個對象的斜坡上，大小相等的梯度轉(zhuǎn)移在同一角度。偏轉(zhuǎn)角時的相對折射率差和相切的幾何角度（ ）的依賴。當介質(zhì)的折射率（N（M））大于對象的折射率（N（S）），偏轉(zhuǎn)是相反時，情況正好相反。當有沒有梯度，有沒有光的偏轉(zhuǎn)通過。

輕者可通過各種機制進行交互，以生成圖像對比度與標本。這些措施包括從表面反射，吸收，折射，偏振，熒光和衍射。對比度也可以增加物理改性顯微鏡的光學元件和照明模式，以及通過攝影或數(shù)字電子技術(shù)的最終圖像的操縱。下面的討論中突出的標本和光和評論的光學顯微鏡技術(shù)已經(jīng)開發(fā)，以提高標本的對比之間的各種相互作用。

當入射光罷工一個不透明的表面，它體現(xiàn)的方式是具體的，表面的地形。非常光滑的表面反射光線的一個角等于入射光，稱為鏡面反射一個機制。表面不均勻或彌漫性往往反映了一個現(xiàn)象稱為漫反射所有可能的角度的光線，在進入目標的光量減少。在反射光顯微鏡的對比度可以提高通過仔細的樣品制備。金相樣品往往蝕??刻反應(yīng)揭示晶界和/或打磨，以增加反映到顯微鏡的光量的液體和氣體。污點，在形式的熒光染料，薄膜，金屬涂料，也可用于引進反射光鏡標本的對比。雙折射標本，可以使用偏振光反射光的和透明的階段對象是經(jīng)常的使用技術(shù)，如反映的微分干涉對比，暗場照明，和霍夫曼調(diào)制對比觀察的成像。

人類的眼睛是非常敏感，在樣本的振幅和波長的差異。出于這個原因，許多標本切成薄片（厚度1-30微米不等），并用化學染料染色可以提高對比度，區(qū)分標本內(nèi)的居住結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)已經(jīng)相當普遍地使用了數(shù)百年的生物標本。染料的選擇性吸收一個或幾個波長的光，并通過或反映所有其他波長。一個例子是一個藍色的例外，這是反映通過試樣傳輸，吸收所有可見光波長的藍色染料。一個生物標本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)元素往往沾有的染料混合物選擇性染色這些元素，加強對他們的背景，不同的顏色是透明或染色的材料對比。

這些技術(shù)也適用于熒光染料，可用于增加具有高度的特異性，在標本的對比。熒光標本之一波長的可見光或近紫外線光刺激時，他們往往發(fā)出的光的波長較長，從而成為可見的，或?qū)Ρ认嘣谕獾鼗虮尘埃▓D6）其他對象。熒光顯微鏡技術(shù)，在顯微鏡底漆的另一部分中詳細討論。

增加染色標本的對比早期和目前使用的方法，利用色彩對比過濾器，Wratten漆明膠廣場（柯達），或在光路中的干擾濾波器。例如，如果一個標本是一個紅色的污點，綠色過濾器會變暗的染色紅色區(qū)域，從而提高對比度。另一方面，綠色過濾器將減輕任何綠色染區(qū)。彩色濾光片是非常有價值的的艾滋病標本的對比，尤其是當黑白顯微攝影是我們的目標。綠色過濾器是使用消色差透鏡的目標，這是糾正球綠燈，相襯的目標，這是假設(shè)使用的綠光，波長操縱設(shè)計特別有價值，因為相標本通常是透明和缺乏固有色。

各向異性材料通常表現(xiàn)出兩個或兩個以上的折射率，因而被稱為雙折射，或雙重折射。其中包括在這一類的標本，礦物，晶體（結(jié)構(gòu)勻稱表現(xiàn)出高度的），纖維，毛發(fā)，和其它生物標本。當光線進入非光纖（光軸以外的軸）軸各向異性晶體，它是折射到每個偏振光的振動方向彼此成直角為導向，并以不同的速度行駛的兩條射線。由此產(chǎn)生的光波是兩極化，可能會干擾時，在顯微鏡分析儀重組產(chǎn)生雙折射標本的圖像都非常重要，并包含一個顯著的對比。

活標本和其他階段的對象，這往往產(chǎn)生較差的圖像，在明照明，是由光而不是化學手段霍夫曼調(diào)制相襯，對比和微分干涉對比照明下觀察清晰可見。這些技術(shù)需要特殊的光學元件，顯微鏡，但通常會產(chǎn)生足夠的對比度的圖像，揭示有關(guān)標本結(jié)構(gòu)的重要細節(jié)。我們的專業(yè)顯微技術(shù) 部分中可以找到一個更深入的討論，這些對比增強技術(shù)。

另一種簡單的技術(shù)，提高對比度，涉及從標本折射率不同的安裝介質(zhì)的選擇。例如，硅藻，可以安裝在各種對比增強介質(zhì)如空氣或商業(yè)中蘇合香。折射率的差異，提高這些無色物體的對比度，呈現(xiàn)其輪廓和標記更為明顯。以下各節(jié)描述了許多現(xiàn)今顯微鏡更復(fù)雜的技術(shù)，以提高標本的對比。

 

光學顯微術(shù)

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光鏡下，所謂的，由于它采取可見光檢測小的物體，可能是生物學中最著名的和使用的研討工具。然而，很多學生和老師都不知情的全方位功效，在光學顯微鏡。由于儀器的本錢增添，其質(zhì)量和多功效性的最好工具，遺憾的是，不可用的大多數(shù)學術(shù)課程。然而，即使是最便宜的“學生”顯微鏡可以供給大自然的壯觀風景，可以使學生進行一些相當龐雜的試驗。

初學者往往以為觀看小物件的挑釁在于獲得足夠的倍率。事實上，當它面臨的最大挑釁是在生活的顯微鏡，為了尋找，

獲得足夠的對照度

尋找焦平面

取得了良好的決定案

認識到這個問題，當人們看到它

最小的對象被以為是生涯的細菌。最小的細菌，可以察看到細胞的外形確認，在短短的100倍的放大倍率。他們是無形的，但在明視場顯微鏡。這些頁面將描寫用來獲取相比之下，標本，并重視對他們的建議，并建議使用光學顯微鏡丈量裝備的光學類型。

光學顯微鏡的種類

明亮的視野顯微鏡是最著名的學生是最有可能被發(fā)現(xiàn)在課堂上的?？赡苡懈玫脑O(shè)備的教室和試驗室的暗場和/或相襯光學。微分干預(yù)對比，Nomarski，霍夫曼調(diào)制對比度和變更發(fā)生相當?shù)纳疃?，分辯??率和立體后果。熒光和共聚焦顯微鏡的專用儀器，用于研討，臨床，和產(chǎn)業(yè)利用。

比其他復(fù)合式顯微鏡，一個簡略的儀器應(yīng)用低倍率也可能在試驗室中被發(fā)明。立體顯微鏡，解剖顯微鏡通常有雙目鏡筒，長工作間隔，和范疇的放大倍率通常是從5倍到35或40倍。有些儀器供給更高的放大倍率的鏡頭，但決定沒有改良。這種“虛偽放大倍率”是很少值得就義。

明視場顯微鏡

隨著傳統(tǒng)的明視野顯微鏡，光從白熾燈源的目標是走向舞臺下方的鏡頭稱為冷凝器，通過標本，通過客觀的鏡頭，并通過第二個放大鏡，眼或目鏡眼。我們看到在光路中的對象，因為自然色素冷靜或污漬接收光線的差別，或者由于他們是厚到足以接收大批的光，盡管被無色。一個草履蟲應(yīng)顯示在明亮的視野顯微鏡相當不錯，固然它并不輕易看到纖毛或大部分細胞器。生涯的細菌不會顯示在所有觀眾命中，除非靠運氣焦平面和曲解使用最大比較度的圖像。

質(zhì)量好顯微鏡有一個內(nèi)置照明燈，可調(diào)光圈（對照度）把持，機械舞臺，和雙目鏡筒冷凝器。冷凝器是通過一個開放的舞臺，把重點放在標本。穿過試樣后，一個顯明的領(lǐng)域是遠大于面積照明，光顯示的眼睛。圖像的放大倍率是物鏡的放大倍率（通常是鏡頭上的機構(gòu)蓋章）倍的目鏡放大倍率。

學生通常使用的粗，細的聚焦旋鈕，用來加強標本的形象。他們經(jīng)常不知道調(diào)整到冷凝器，可以影響辨別率和對比度。有些冷凝器固定地位，其他人可聚焦，使光的質(zhì)量可以調(diào)節(jié)。通常一個可聚焦冷凝器的最佳地位是盡可能接近的階段。明亮的范疇冷凝器通常包括光圈，裝備把持的光的光束通過冷凝器直徑，這樣，當隔膜才停了下來（近封閉）光直線上升，通過聚光鏡中心和對照度高。當隔膜是敞開的圖像亮度和對比度低。

單靠一個對比光圈的毛病是超越一個最佳點多比較發(fā)生扭曲的形象。用一個小的，未染色，unpigmented的標本中，您通常過往最佳的對比度，當你開端看到的圖像。

使用明場顯微鏡

首先，想想你想要做什么用顯微鏡。什么是您須要的最大放大倍率？你在尋找染色標本嗎？你需要多少的對比/辨別率？接下來，開端設(shè)立觀看。

安裝在舞臺上的標本

如果有一個蓋玻片必需。高放大倍率的物鏡無法集中精神通過厚厚的玻璃幻燈片;他們必須提請封閉的標本，這就是為什么蓋玻片是如此之薄?？赡芘鋫淞撕喡缘募糨嫞ǜ畠r顯微鏡），或與一些幻燈片固定舞臺?；脽羝?，可能需要手動定位，或有可能是機械的階段（首選），容許在不觸摸滑動精斷定位。

優(yōu)化照明

A光源應(yīng)當有一個寬廣的動態(tài)范疇，供給高放大倍率，低強度，高強度的照明，使用戶可以查看在低放大倍率的舒適。更好的顯微鏡有一個內(nèi)置照明燈，和最好的顯微鏡對光照強度和外形的光束把持。如果您的顯微鏡需要一個外部的光源，確保旨在向冷凝器中的光。調(diào)整光照，使該字段是不損害眼睛明亮。

調(diào)整冷凝器

要調(diào)劑和調(diào)整的顯微鏡，開端瀏覽手冊。如果沒有可用的手冊，請嘗試使用這些準則。如果冷凝器是可聚焦，地位與鏡頭盡量靠近你可以得到它在現(xiàn)階段開放。如果冷凝器可選擇的選項，將它設(shè)置為明亮的范疇。光圈開始，才停了下來（高對比度）。您應(yīng)當看到的光，通過試樣轉(zhuǎn)變亮度，當您移動光圈桿。

想想你在找什么

這是一個很大很難找到的顯微鏡，你有沒有期看其apprearance時。它有多大？它會移動嗎？它是色素或染色，若有什么是它的色彩嗎？你盼望在哪里找到它在幻燈片上？例如，學生由于用肉眼和低放大倍率的顯微鏡看起來像污垢通常有很多麻煩找到沾上細菌。它有助于懂得涂片干下來，他們通常會留下戒指，使一抹黑的邊沿通常有最密集的細胞濃度。

聚焦，定位，和中心的標本

最低放大倍率的物鏡，家里的標本和/或您想檢討的標本的一部離開始。找到并重點組織部分，特殊是如果他們是固定的，與大多數(shù)籌備幻燈片染色，這是很輕易的。然而，它可以很難找到生涯，如細菌或unpigmented原生生物標天職鐘。一個酵母細胞的懸浮液，使得一個好的做法標本，尋找艱苦對象。

應(yīng)用暗場模式（假如有的話）發(fā)明未染色標本。如果沒有，開始與高對比度（光圈關(guān)閉）。

與標本，重點啟動，這樣帶來的階段和目的，必需緊密接洽起來。第一面成為關(guān)注的焦點，為您帶來階段和客觀蓋玻片上方。隨著涂片，蓋玻片經(jīng)常不使用，所以你首先看到的是涂片本身。

假如您有問題，著眼于蓋玻片或氣泡，或顯微鏡，你可以很輕易地辨認邊沿。蓋玻片的頂部邊沿首先成為關(guān)注的焦點，然后底部，應(yīng)在同一平面上為您的標本。

一旦你發(fā)明的標本，調(diào)整比較度和光照強度，移動幻燈片，直到你有一個好的區(qū)域觀看。

調(diào)整目鏡分別，重點

一個單一的眼，沒有什么做目鏡，除了堅持它的干凈。用雙目顯微鏡（首選），你須要調(diào)劑目鏡的分別，就像你做一個雙筒看遠鏡。雙眼視力比單眼視力，光線和細節(jié)更敏感，所以如果你有一個雙目顯微鏡，應(yīng)用它。

一個或兩個目鏡可伸縮式目鏡，那就是，你可以集中精神。由于極少數(shù)人的眼睛是完整匹配的，我們最需要的重點工作之一目鏡，以配合其他圖像。尋找到固定目鏡恰當?shù)难鄄亢椭攸c用顯微鏡調(diào)焦旋鈕。接下來，看看可調(diào)目鏡（與另一只眼睛當然），調(diào)劑目鏡，顯微鏡。

選擇觀看的物鏡

功耗最低的鏡頭通常是3.5或4倍，重要用于最初發(fā)現(xiàn)的標本。我們有時正是由于這一原因，掃描鏡頭。最常用的物鏡，是10倍的鏡頭，給人以10倍的目鏡放大倍率的100X的最后。對于非常小的原生生物和籌備幻燈片，如細胞器或核決裂的具體信息，您將需要更高的放大倍率。典范的高倍率鏡頭，40倍和97x或100倍。后兩種放大倍率是用石油專用，以進步辨別率。

按步驟的放大移動。每次往功率更高的目的，重新聚焦和重新中心的標本。高倍率鏡頭，必需在物理上更接近試樣本身，這對干擾到標本的客觀風險。對焦時非常謹嚴。順便說一下，鏡片的質(zhì)量好集齊焦，也就是說，當您切換放大倍率的標本中的重點仍然或封閉，以集中。

更大并不總是更好。所有的標本有三個方面，一個標本，除非是非常薄的，你將無法對焦用高放大倍率的目標。放大倍率越高，就越難是“追逐”的移動標本。

調(diào)整為選定的物鏡的照明

無論使用的放大倍率目鏡顯明的范疇是恒定的。所以，當你進步放大倍率照明試樣的面積，你看到的是更小的。既然你是在尋找一個較小的區(qū)域，更少的光線達到眼睛，和圖像變暗。一個低功耗的目的，你可能要削減光照強度。隨著高功率，你須要，特殊是與較昂貴的顯微鏡，你可以得到所有的光線。

當使用亮場顯微鏡

亮視野顯微鏡是最合適觀看的染色或自然色素標本，如染色的組織切片或居住的光合生物籌備幻燈片。它是無用的活標本的細菌，和非光合原生生物和后活潑物，或不染的細胞懸液或組織切片下。這里是一個不那么完全列表可能使用明場顯微鏡察看的標本，和恰當?shù)姆糯蟊堵剩ㄊ走x的終極放大倍率強調(diào)）的。

編寫的幻燈片，彩色 細菌（1000倍），厚的組織切片（100X，400X），簡明染色體或特別染色的細胞器（1000倍），大型原生生物或后活潑物（100X）的薄片。

涂片，染色 血液（400倍，1000倍），負沾上細菌（400倍，1000倍）。

生活的預(yù)備工作（濕坐騎，不染） 池塘里的水（40X，100X，400X），生活的原生生物或后活潑物（40X，100X，400X偶然），藻類和其他微觀植物資料（40X，100X，400X）。較小的標本將難以察看到的不失真，特殊是假如他們無色素冷靜。

在顯微鏡的護理

質(zhì)量好顯微鏡上的一切是難以置信的昂貴，所以要警惕。

堅持顯微鏡，只有堅定的態(tài)度。不要搶目鏡持有人，例如。

拔出照明燈時，握住插頭（而不是電纜）。

由于燈泡是昂貴的，有一個有限的性命，當您完成時封閉照明燈。

務(wù)必確保舞臺和鏡頭干凈敷上了顯微鏡。

從來不使用紙巾，kimwipe，你的襯衫，或任何其他資料比質(zhì)量好的鏡頭紙或棉簽（必須是100％自然棉）清潔光學表面。要溫順！您可以使用一個適合的鏡頭干凈水或蒸餾水，以輔助打消干燥物料。有機溶劑可能單獨或破壞的鏡片或涂料。

蓋在不應(yīng)用時用防塵套儀器。

焦點順利;不要試圖通過聚焦的進程中或強迫任何速度。例如，如果您碰到阻力增大，對焦時，那么你可能已經(jīng)到達了極限，你在過錯的方向。