顯微鏡活體成像實(shí)驗(yàn)的總結(jié)
總結(jié):熒光信號(hào)發(fā)射波長越大,成像儀越靈敏,操作手法越成熟,可以探測到的組織器官越深。
體內(nèi)成像 兩個(gè)關(guān)鍵因素:信號(hào)源、探測器(活體成像儀,包括探頭和激發(fā)光)
一、假如是轉(zhuǎn)基因方式標(biāo)記目標(biāo),信號(hào)標(biāo)記一般是 GFP RFP HRP,直接用熒光染料標(biāo)記的QDot較多
GFP 轉(zhuǎn)染技術(shù)相對成熟,GFP基因也容易獲?。蝗秉c(diǎn)是發(fā)出的綠光波長較短 穿透力差 特別是脊椎動(dòng)物的紅色素影響(肌紅蛋白 血紅蛋白) 成像往往很模糊 ,只能淺表成像
RFP 相對GFP優(yōu)勢明顯,波長廠,穿透力強(qiáng),操作也不繁瑣,可以深度成像;但是,體外光源透射動(dòng)物體,得到的往往是紅光,也就是說,信號(hào)和背景往往混合,讓結(jié)果不明顯
前兩種都是熒光蛋白(綠色、紅色)優(yōu)勢是成像處理簡單 ;缺點(diǎn)是成像時(shí)間不長(特別是GFP)信號(hào)隨曝光時(shí)間衰減,激發(fā)光越強(qiáng) 衰減越快。
HRP 不但波長適中,而且成像時(shí)間長,沒有信號(hào)衰減的煩惱;缺點(diǎn)是操作復(fù)雜,其顯像底物對動(dòng)物有一定的毒性(注射底物后才能發(fā)光)
熒光染料直接標(biāo)記,傳統(tǒng)的 Rhodamine、FITC 等使用很少,因?yàn)槠湫Чc熒光蛋白差別不大,同樣有衰減(據(jù)稱 Alexa Fluor系列 衰減很少)
Qdot 成像操作與熒光蛋白相同,波長范圍廣,無衰減,可以多色標(biāo)記,無毒性;缺點(diǎn)是無機(jī)染料,不能伴隨實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一生,標(biāo)記操作也復(fù)雜。
總體來說,2008年元月前體內(nèi)標(biāo)記的方法就這幾種,至于近兩年有沒有新技術(shù),不敢妄言。
二、成像儀方面
激發(fā)光源有 全波長激發(fā)和激光激發(fā)兩種:全波長可以一次性成像,但信號(hào)較弱,干擾也比較大;激光信號(hào)強(qiáng),背景可以特征性去除,但成像較慢,多信號(hào)成像,成本偏高。
探頭一般是CCD 但是冷卻溫度不同--一般說來,溫度越低,背景信號(hào)少,可以探測若信號(hào)。也有CMOS探頭,成像效果更好,但專業(yè)CMOS價(jià)格高昂。
三、操作方法
假如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是哺乳動(dòng)物,檢測前最好褪毛處理,毛發(fā)對光的吸收很強(qiáng)
輕度麻醉,防止動(dòng)物活動(dòng)或代謝過快
檢測時(shí)間短,重復(fù)性好
。。。具體事項(xiàng)很多,
總之,活體成像各個(gè)實(shí)驗(yàn)都不一樣,成功與否取決于對整套方法的熟悉,敢于嘗試是關(guān)鍵。
本文顯微鏡信息轉(zhuǎn)載于http://www.xianweijing.org/顯微鏡百科
如何確定普通顯微鏡細(xì)胞照片的放大比例
詳細(xì)的顯微鏡的測微尺的操作方法