共焦點顯微鏡脊髓的免疫熒光protocol組化流程

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1.動物麻醉后經(jīng)心臟插管至主動脈,灌注生理鹽水約300-400ml后,再灌入4%多聚甲醛(含1.5%苦味酸，0.01mol/L PBS)約300ml.取腰部脊髓放入上述溶液里后固定3h。
2.將脊髓組織移入15%蔗糖（0.01mol/L PBS)固定4度過夜沉底.取出組織濾干pbs，放入盛有液氮的小盒冷卻直至oct變白固定。
3.冷凍切片20um（文獻是30um）。放在載玻片上。
4.PBS振洗，5min，3次。
5.吸去多余的pbs，用DAKO pen在組織周圍畫圈，加入2%正常山羊血清含0.3％Triton x-100的0.01M PBS。封閉30分鐘。
6.滴加一抗（gfap,mouse IgG1），于濕潤箱內(nèi)4度過夜。
7.PBS振洗，5min，4次。
8.此處開始遮光，分別滴加二抗(gfap, goat anti-mouse IgG1 FITC)，放入熒光用濕潤箱里，4度過夜。
9.PBS振洗5min，4次。
10.封片劑封片，nail oil裱片。
11.暗室操作共焦點顯微鏡觀察。 

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