新一代測序（NGS）的應(yīng)用范圍越來越廣，特別在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）領(lǐng)域有著越來越成熟的應(yīng)用。對于NGS 的文庫制備，我們經(jīng)常需要對起始核酸樣品進(jìn)行質(zhì)量評估，而制備好的文庫我們也要進(jìn)行準(zhǔn)確的濃度檢測以進(jìn)行后續(xù)的均一化。

通常核酸濃度測定是首先測定樣品在260 nm 下的吸光值，然后用特定的換算因子進(jìn)行濃度計算。但吸收光法靈敏度較低，并且當(dāng)樣本中存在其他種類核酸污染時，無法進(jìn)行特異性定量。

圖1：吸收光法dsDNA檢測，分別進(jìn)行濃度和純度（A260/A280）的測定。
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其實，測定核酸濃度還有一種方法，即通過熒光染料進(jìn)行間接檢測。熒光染料能夠特異性地和目的核酸結(jié)合，靈敏度也比傳統(tǒng)的光吸收法高出1000 到10000 倍。

熒光檢測和吸收光檢測的比較

常見有Qubit 和PicoGreen 熒光定量試劑盒用于dsDNA 的定量。對于同一樣品，分別采用PicoGreen定量試劑盒（配合Eppendorf BioSpectrometer fluorescence 分光光度計和UVette比色皿）和Qubit dsDNA HS 定量試劑盒（配合Life technologies? Qubit 2.0 熒光計和專用0.5 mL? 反應(yīng)管）進(jìn)行熒光法核酸定量。PicoGreen 的檢測結(jié)果與Qubit 僅相差10% 左右，兩者都能準(zhǔn)確地反映樣品的實際濃度。

當(dāng)然，吸收光法也有它的優(yōu)勢。首先，吸收光法可提供A260/A280和A260/A230比率，用來評價核酸樣品的純度。 其次，它的使用成本低，不需要配套試劑盒。并且操作更簡便，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接進(jìn)行檢測。
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其實，NGS的實際應(yīng)用中，既需要Qubit類的熒光計進(jìn)行準(zhǔn)確核酸定量，也需要吸收光分光光度計進(jìn)行快速純度檢測，而集兩種功能于一身的 Eppendorf BioSpectrometer fluorescence熒光款分光光度計是您的理想選擇。

另外，在BioSpectrometer fluorescence軟件中預(yù)設(shè)了“PicoGreen short”簡短程序，即只有0和500ng/mL兩個標(biāo)準(zhǔn)品。該方法的優(yōu)勢是操作簡便快速，并節(jié)約昂貴的熒光檢測試劑。而“PicoGreen short”得到的樣品濃度與常規(guī)五個標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析得到的樣品濃度非常相近。

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在BioSpectrometer fluorescence上不同熒光方法的核酸定量，采用Eppendorf Macro Vis Cuvettes比色皿，左圖為PicoGreen程序，右圖為PicoGreen-short程序。

其實BioSpectrometer fluorescence與Eppendorf Vis Cuvette常量比色皿、Eppendorf UVette微量比色皿或 Eppendorf μCuvette G1.0 超微量比色皿均可以配合使用。

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Eppendorf不同規(guī)格比色皿，左圖- Vis Cuvette常量比色皿，中圖-UVette微量比色皿，? 右圖- μCuvette G1.0 超微量比色皿

而采用UVette 或μCuvette G1.0可以顯著降低測量體積，100 μL或5μL足夠進(jìn)行測量。這樣可以節(jié)約熒光試劑，配合“PicoGreen short”程序（1個樣品對應(yīng)3個反應(yīng)，而對于PicoGreen程序1個樣品對應(yīng)6個反應(yīng)）可大大降低試劑成本。

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不同規(guī)格比色皿的PicoGreen檢測成本比較

另外，分別用UVette和μCuvette G1.0在Eppendorf BioSpectrometer fluorescence分光光度計上基于“PicoGreen short”應(yīng)用程序進(jìn)行兩個樣品的熒光法核酸定量。兩種比色皿的檢測結(jié)果相當(dāng)，重復(fù)性好。

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因此，Eppendorf BioSpectrometer fluorescence配合UVette塑料比色皿或 μCuvette G1.0 超微量比色皿，采用“PicoGreen short”預(yù)設(shè)應(yīng)用程序，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，還能減少熒光試劑的消耗。同時該儀器的吸收光功能還能提供核酸純度的相關(guān)信息，從而對NGS文庫進(jìn)行準(zhǔn)確而可靠的質(zhì)量評估。