從古至今，人類一直在追尋更高更遠的真相，從遠洋航行到太空探索，人們不斷征服一個個宏偉的目標，但是人們?nèi)庋鬯姷暮暧^世界不是世界的全部，還有人眼無法看清的微觀世界，它同樣也吸引著無數(shù)人去探索和追尋。

無論宏觀還是微觀事物，我們的觀測都是基于三維空間的屬性，即XYZ三維，而對事物形態(tài)變化的觀察則需要再引入一個衡量因素--時間T，因此對事物觀察的最完備方式一定是XYZT的同時記錄，即形態(tài)+時間的長時間攝影，這也是顯微鏡的終極功能。

經(jīng)過三百多年的發(fā)展，現(xiàn)代顯微鏡提出分辨率、景深、視野等概念，并不斷提出解決方案，顯微鏡已經(jīng)初步滿足我們對微觀世界觀察的需求，幫助我們記錄下微觀世界的空間和時間。

微觀世界觀察最重要的是細節(jié)的分辨，分辨率的概念便由此誕生，分辨率是指人眼可以區(qū)分的兩個點之間的最小距離，只在XY維度有效，根據(jù)瑞利判據(jù)，Rayleigh Criterion，正常人能分辨的極限是明視距離25cm處0.2mm的兩個點，當我們使用顯微鏡后，我們可以看清更小距離的兩個點，這便提升了我們觀察的分辨率。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，人們對分辨率的要求也在不斷提高，而科學家們也在不斷的提升顯微鏡的分辨率，如電子顯微鏡將分辨率提升至納米級別，實現(xiàn)了對病毒的觀察，超高顯微成像技術(shù)，將顯微鏡的分辨率從200納米提升到幾十納米，實現(xiàn)了對活細胞細胞器的觀察。

分辨率的提升也帶來了新的問題，即視野和景深的減小，當用普通中央照明法（使光線均勻地透過標本的明視照明法）時，顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA，可見光波長范圍為400—700nm，取其平均波長550nm，波長是固定常量，因此，增大NA數(shù)值，即可得到更小的D值，也就是可以分辨的兩點之間的距離更小，可以讓人眼看清楚更小的物體。

NA值即數(shù)值孔徑，描述了透鏡收光錐角的大小，NA = n * sinα，即透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和孔徑角（2α）半數(shù)的正弦之乘積。n為物鏡與樣本之間介質(zhì)的光折射率，當顯微鏡物方介質(zhì)為空氣時，折射率n = 1 , 采用折射率高于空氣的介質(zhì)，可以顯著提高NA值，水浸介質(zhì)是蒸餾水，折射率為1.33；油浸物鏡介質(zhì)是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52左右，接近透鏡和載玻片的折射率，因此，油鏡的NA值高于空氣鏡。

孔徑角又稱“鏡口角”，是透鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度，增大鏡口角，可以提高正弦值，其實際上限約為72度（正弦值為0.95），乘以香柏油折射率1.52，可以得出最大NA值為1.45左右，代入分辨率計算公式，可以得出常規(guī)顯微鏡極限XY平面分辨率為0.2um左右。

NA值還會直接影響顯微鏡的視野亮度（B）。由公式B∝N.A.2/ M2?我們可以推出，亮度隨數(shù)值孔徑（N.A.）的增大或者物鏡倍率（M）的降低而增加。

從理論上來說，我們應(yīng)該追求盡可能高的NA值，以獲得更好的XY平面分辨率和視野亮度。然而凡事都有兩面性，XY平面分辨率的提升，會帶來Z軸景深和觀察視野的減小。

顯微鏡一般都是垂直向下取景的，通過視場直徑內(nèi)觀察到的物體表面凸起的位置與凹下的位置都能夠看的很清楚時，那么凸點與凹點之間的高度差就是景深了，對于顯微鏡來說景深越大越好，景深越大在觀察高低不平整的物體表面時，能夠得到更好更立體的清晰度畫面，大景深有助于我們對微觀世界進行垂直方向形態(tài)的觀察，也就是XYZ三維形態(tài)中的Z軸信息。

景深就是象平面上清晰的象所對應(yīng)物平面的前后空間的深度：dtot=(λ*n)/NA + n/(M?NA) * e，dtot：景深，NA ：數(shù)值孔徑，M ：總放大率，λ：光波波長, （通常λ=0.55um），n: 試樣與物鏡之間介質(zhì)的折射率（空氣: n=1、油: n=1.52）根據(jù)這個公式，我們可以知道，Z軸景深與XY平面NA值成反比。

除了景深外，視野也受到NA值的影響，通過儀器固定注視一點時所能看見的空間范圍即視野，它的計算與物鏡的放大倍數(shù)直接相關(guān)，觀察所看到的實際視野直徑等于視場直徑除以物鏡的放大倍數(shù)，目鏡會表明對應(yīng)視場數(shù)，如10/18，即放大倍數(shù)10倍，視場直徑18mm，因此當目鏡確定后，放大倍數(shù)越大則觀察的視野越小。

XY平面分辨率是對局部細節(jié)的解析，而視野則決定了我們對樣本的觀察范圍，視野必然是越大越好，但受限于當前的技術(shù)，我們必須采用高倍物鏡，才可以得到良好的NA值，因此,視野和NA值有間接的負相關(guān)系。

當我們需要觀察的樣本大于我們的視野時，每次觀察只能看到一個局部，為了解決這個問題，拼圖技術(shù)便應(yīng)運而生。通過在XY方向移動樣本，連續(xù)拍下不同位置的圖像，最后拼接在一起，就可以得到一張全視野的圖像。

▲鏡下局部視野

▲拼接后全視野

▲手動拼接

▲自動拼接(圖源：Echo顯微鏡)

拼接分為手動和自動兩種，手動拼圖成本低廉，但是對人員的操作水平，經(jīng)驗要求很高，如上圖，操作人員稍有不慎，就會出現(xiàn)圖片接縫問題，同時手動拼圖速度慢，不適合大批量，高通量樣本處理，比如醫(yī)院病理科日均上百病理切片觀察，手動拼圖方式無法滿足要求。

自動拼圖的核心部件是全自動載物臺，結(jié)合軟件，可自動實現(xiàn)全自動，大范圍全視野拍攝，結(jié)合自動Z軸對焦補償，即可得到全視野的清晰圖像。

Echo Revolution 全自動熒光顯微鏡

Echo Revolution全自動熒光顯微鏡，將XYZ三軸全部實現(xiàn)電動化，從而實現(xiàn)自動完成多圖拼接的大視野高分辨率成像，而電動化的Z軸可以幫助用戶實現(xiàn)自動聚焦、自動定焦和Z-Stacking 多層掃描大景深成像。Echo Revolution全自動熒光顯微鏡還添加了延時攝影功能，可以幫助用戶實現(xiàn)長時間觀察和時間回溯，使用戶可以進行更全面的觀察實驗。