若要針對一個(gè)不同尺寸的柱調(diào)整一種美國藥典(USP)方法或滿足未能滿足的系統(tǒng)適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)，在沒有重新確認(rèn)方法的情況下可進(jìn)行何種程度的修改?

　　一位同事最近要我為“LC故障排查”寫一篇最新報(bào)道，論述美國藥典公約現(xiàn)行方法液相色譜法(LC)專業(yè)人員談話時(shí)，這都是一個(gè)關(guān)于研究范圍的熱門話題。當(dāng)前所討論的指導(dǎo)準(zhǔn)則源自美國藥典第621章(由美國藥典[USP]進(jìn)行簡化，此處為<621>)(1)。美國藥典至少每兩年更新一次，因此最好查閱最新版本查看是否有任何變化。我在此處使用的是2017年5月1日生效的“美國藥典40-國家處方集35”(USP 40-NF 35)(1)。

　　首先我要指出一種我經(jīng)常遇到的錯(cuò)誤觀念。由于USP<621>已經(jīng)成為色譜法調(diào)整規(guī)則的事實(shí)標(biāo)準(zhǔn)，許多使用者認(rèn)為這意味著所有方法。事實(shí)上，<621>僅適用于美國藥典中公布的專著所述方法。這意味著其不適用于實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)和驗(yàn)證的方法、科學(xué)文獻(xiàn)中獲取的方法或從其他來源得到的方法。綜上所述，大多數(shù)指導(dǎo)準(zhǔn)則都可作為其他許多類型的方法的調(diào)整依據(jù)。例如，您可以將其用作自有實(shí)驗(yàn)室方法調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的依據(jù)，但在此種情況下，它們只是您自己的指導(dǎo)準(zhǔn)則，而非美國藥典公約指導(dǎo)準(zhǔn)則。最后，當(dāng)前論述中的指導(dǎo)準(zhǔn)則解釋完全基于我自己的觀點(diǎn)，而非美國藥典公約或他方的官方意見。

　　系統(tǒng)適用性

　　良好的系統(tǒng)適用性測試是任何液相色譜法可靠運(yùn)行的關(guān)鍵。此項(xiàng)測試有助于驗(yàn)證整套方法的效果是否好到足以產(chǎn)生精度和準(zhǔn)確度均滿足要求的分析結(jié)果。系統(tǒng)適用性測試通常要對保留時(shí)間、柱效率、分辨率、峰拖尾、檢測器響應(yīng)值、精確度和準(zhǔn)確度等特征進(jìn)行一定程度的評估。因此，美國藥典對系統(tǒng)適用性的密切關(guān)注也就不足為奇(1)：

　　指定色譜系統(tǒng)可能需要進(jìn)行調(diào)整，以滿足系統(tǒng)適用性要求。為滿足系統(tǒng)適用性要求而對色譜系統(tǒng)進(jìn)行的調(diào)整不是為了彌補(bǔ)柱故障或系統(tǒng)運(yùn)行失常。只有當(dāng)調(diào)整或換柱所得色譜符合官方程序規(guī)定的所有系統(tǒng)適用性要求時(shí)，調(diào)整才能得到認(rèn)可。

　　我對這句話的理解是：若調(diào)整未超出推薦范圍，且經(jīng)調(diào)整后通過了系統(tǒng)適用性測試，則調(diào)整將獲得認(rèn)可。若要繼續(xù)使用該方法，我只需對調(diào)整進(jìn)行文件記錄(并滿足我公司所有內(nèi)部要求)，無需進(jìn)行重新驗(yàn)證。若超出調(diào)整限值，調(diào)整將被視作方法修改或更高，因此需要進(jìn)行一定水平的重新驗(yàn)證。

　　接下來讓我們探討一下USP<621>所列各種調(diào)整情形。部分調(diào)整可適用于等度或梯度方法，而其他調(diào)整則不具普適性。我將各種調(diào)整情形總結(jié)于表1中。表1最好連同下列論述一同解讀，因?yàn)橄铝姓撌隹紤]了調(diào)整的細(xì)微差別。我對此無法找出具體陳述，但表1所列各種變化適用于反相分離，因此我假設(shè)這就是意圖。

　　pH

　　如表1所示，流動(dòng)相緩沖液pH容許調(diào)整范圍為±0.2單位。乍一看，這就像是一個(gè)合理容限。但實(shí)際上，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在使用pH計(jì)時(shí)都會考慮±0.05-0.1pH單位的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室變化。因此應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)變化量乘以二。例如，標(biāo)稱pH為2.5的方法可在“2.3≤pH≤2.7”范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。應(yīng)用這些指導(dǎo)準(zhǔn)則時(shí)必須特別仔細(xì)-我收集的一副色譜中一個(gè)分辨率較高的峰對退化成了pH變化僅為0.1單位的兩個(gè)幾乎沒有任何區(qū)別的凸起。其他有關(guān)pH調(diào)整的注意事項(xiàng)參見最新出版的“LC故障排查”pH部分(2)。

　　緩沖液濃度

　　USP指導(dǎo)允許緩沖液濃度存在±10%的變化幅度。我對此沒有異議，但我懷疑您可能無法觀察到反相法中如此微小的變化，除非該方法此時(shí)緩沖液不足或者位于飽和點(diǎn)附近?；叵肷显驴?3)表1相關(guān)正交影響的論述，緩沖液濃度的雙倍變化在反相條件下不會改變選擇性。我認(rèn)為緩沖液濃度為25mM的方法在色譜不發(fā)生明顯變化的情況下無法在10-50mM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。就反相液相色譜而言，±10%的限值范圍對我沒有任何意義。盡管如此，離子相互作用較為重要時(shí)(例如離子交換色譜法或親水作用色譜法(HILIC))，緩沖液濃度能夠發(fā)揮重要作;因此，我們不能說緩沖液濃度永遠(yuǎn)不會改變色譜分離。

　　流動(dòng)相的組成

　　表1所列流動(dòng)相組成相關(guān)說明似乎有些令人困惑：流動(dòng)相微量組分±30%相對變化，但不超過±10%。幾個(gè)實(shí)例便可將其解釋清楚。首先考慮50:50A-B的流動(dòng)相，其中“A”表示液體部分(緩沖液或水)，“B”表示有機(jī)物(通常為乙腈或甲醇)-50%的30%是15%，由于15%大于10%，溶劑濃度辯護(hù)不能超過10%。因此，我們可以從40:60 A-B轉(zhuǎn)變?yōu)?0:40 A-B。這是一項(xiàng)簡單的計(jì)算，但變化對我而言有些極端-您什么時(shí)候見過流動(dòng)相乙腈變化達(dá)±10%時(shí)仍能正常運(yùn)行?要謹(jǐn)記最近關(guān)于保留的論述中所提出的“三倍法則”(4)，流動(dòng)相有機(jī)部分變化10%可使保留系數(shù)(或良好保留峰的保留時(shí)間)變化三倍左右。因此，在使用美國藥典流動(dòng)相調(diào)整指導(dǎo)準(zhǔn)則時(shí)務(wù)必小心仔細(xì)。

　　A和B的濃度存在顯著差異會出現(xiàn)何種情況(例如：5%的緩沖液和95%的已經(jīng))?此種情況下，緩沖液濃度的30%等于1.5%，遠(yuǎn)低于±10%的限值。此時(shí)的容許范圍為3.5:96.5~6.5:93.5 A-B;看起來是一個(gè)合理的容許范圍。

　　三元流動(dòng)相的計(jì)算稍微復(fù)雜一些：例如，有35：5:60 A-B-C組成的流動(dòng)相，其中C是指第二種有機(jī)溶劑。該例中，30%的30%等于10.5%，因此A的變化限值為10%。我們可使用上文針對B計(jì)算得出的1.5%調(diào)整率。容許調(diào)整可以是A的35±10%與B的5±1.5%以及C剩余部分的任意組合。您會發(fā)現(xiàn)這里允許存在相當(dāng)明顯的變化-再次提醒大家注意這些變化。

　　紫外檢測器波長

　　檢測器波長指導(dǎo)準(zhǔn)則有點(diǎn)兒領(lǐng)人費(fèi)解。檢測器波長不容改變，但如果第二個(gè)檢測器超出校準(zhǔn)值3mm以內(nèi)，則可投入使用。那么，如果我不想使用當(dāng)前的波長，我會使用一個(gè)無法正常運(yùn)行的檢測器嗎?當(dāng)然不會!調(diào)整說明就像來自檢測器標(biāo)定還是一種常見問題的時(shí)代的“古董”。如今使用的大部分紫外(UV)檢測器在啟動(dòng)后都可自動(dòng)校準(zhǔn)檢查，并在過程中進(jìn)行自校準(zhǔn)。我已經(jīng)20年沒有見到過紫外探測器校準(zhǔn)問題了，估計(jì)只有掉落或其他誤用情形才會導(dǎo)致檢測器出現(xiàn)校準(zhǔn)問題。

　　柱長和顆粒尺寸

　　經(jīng)允許的柱相關(guān)修改是美國藥典做出最大改變以改善應(yīng)用靈活性的領(lǐng)域之一。直到2012年(USP 35-NF 30)，允許發(fā)生的變化還十分有限。例如，柱長L可改變+70%，這看起來幅度相當(dāng)大。您可以將150mm柱換成250mm柱(250/150=±67%)或?qū)⒅L從150mm調(diào)整為100mm(-33%)或50mm(-67%)，似乎都不會有什么問題。您還可以將顆粒尺寸dp減小50%，但不能增加。因此，5μm(-40%)，但不要改的過小。上述推薦做法存在一個(gè)明顯缺陷，就是：其忽略了柱長和顆粒尺寸對色譜柱塔板數(shù)以及分辨率的影響。此外，這些推薦做法無法將5μm顆粒柱調(diào)整為≤2μm顆粒的超高壓LC(UHPLC)柱，或?qū)HPLC方法調(diào)整為更強(qiáng)大的日常作業(yè)用5μm顆粒。因此，盡管這些容限已使用多年并可實(shí)現(xiàn)極具實(shí)用性的變化(例如：從舊式250mm 105μm柱轉(zhuǎn)換為目前廣泛使用的更標(biāo)準(zhǔn)的150mm 5μm柱)，但它們并不適合如今的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

　　但現(xiàn)在有一種更加靈活的容限，其采用更加嚴(yán)密的科學(xué)依據(jù)，核心內(nèi)容是確保色譜柱塔板數(shù)和相應(yīng)的分辨率具備相當(dāng)高的穩(wěn)定性。由于板數(shù)是柱長度與粒徑之商的函數(shù)，L/dp比在這里是一項(xiàng)關(guān)鍵因素。只要L/dp保持恒定，便可改變柱長和粒徑;該結(jié)果中的容許變化范圍為-25%~+50%，其具有一定的意義，用為市售產(chǎn)品的離散柱長和粒徑數(shù)量有限。

　　表2內(nèi)容摘自美國藥典現(xiàn)行版本(1)，包含部分可實(shí)現(xiàn)更改的實(shí)例。美國藥典許多專著方法已相當(dāng)落后，規(guī)定的柱規(guī)格為250mm×4.6mm，10-μmdp(L/dp=25000)。您可以將該方法輕松升級為150mm×4.6mm，5μmdp(L/dp=30000);如此一來，L/dp可增加20%，未超出限值范圍。若傾向于使用較小的顆粒，則可使用100mm×4.6mm，3μmdp(L/dp=33000);注意，我在這里為方便陳述而對數(shù)值進(jìn)行了四舍五入。您甚至可以使用UHPLC以及裝滿1.7μm顆粒的50mm管柱(L/dp=29400)，且仍不超出限值范圍。上述所有管柱均提供大致相同的板數(shù)，因此可實(shí)現(xiàn)相同的分離效果。此種情況的假設(shè)條件是所有管柱都具備相同的化學(xué)性質(zhì)(具有相同的鍵合相;來自相同制造商;采用相同包裝品牌)。然而，我們不需要過于擔(dān)心化學(xué)變化，因?yàn)椋喝粢獫M足要求，方法還須通過系統(tǒng)適用性測試，任何無法接受的化學(xué)變化都會導(dǎo)致系統(tǒng)適用性試驗(yàn)失敗。

　　若使用相同類型顆粒(最常見的顆粒類型是完全多孔顆粒TPP)，L/dp方法效果極佳。盡管如此，從TPP轉(zhuǎn)換為應(yīng)用日益廣泛的表面多孔顆粒(SPP)時(shí)，此項(xiàng)技術(shù)會出現(xiàn)分化。SPP所提供的板數(shù)通常對應(yīng)尺寸更小的顆粒，因此，采用L/dp方法時(shí)粒徑可能會產(chǎn)生誤導(dǎo)。例如，2.7μm dp SPP柱具有~3μm dp SPP柱的背壓，但板數(shù)卻更接近~1.8μm dp SPP柱。因此，上例中50mm，2.7μm SPP柱的L/dp=18500：若從250mm，10μm柱攥起，則劇減26%，但與150mm，5μm柱相比降低近40%。根據(jù)L/dp結(jié)果放棄SPP柱并無科學(xué)意義;相反，在存在一種可選容限，規(guī)定板數(shù)N應(yīng)在相同的-25℃~+50℃范圍內(nèi)保持恒定。此種情況下，SPP柱將是一種可接受的替代技術(shù)(假設(shè)已經(jīng)通過系統(tǒng)適用性測試)。

　　柱徑和流量

　　只要流量F調(diào)整時(shí)確保流動(dòng)相線速度保持恒定，柱徑dc便可更改。理論上講，最大柱效對應(yīng)線速度隨著粒徑的改變出現(xiàn)反向增加。針對粒徑而調(diào)整線速度時(shí)最好參照降低的速度。我們當(dāng)中大多數(shù)人都不會擔(dān)心這種額外的調(diào)整，但其包含于方程1(1)中，使所需調(diào)整簡單明了。除基于方程1而允許進(jìn)行的更改之外，流量最大調(diào)整幅度為±50%。

　　其中，下標(biāo)標(biāo)識原柱1和新柱2的變量。

　　表2所列實(shí)例描述了250mm×4.6mm，10μm柱以150mm柱一半的流量運(yùn)行。假設(shè)初始流量為1.0mL/min，我們會將流量減小至0.5mL/min，以獲得相同的較低速度。盡管如此，較低流量與較大柱長的組合會導(dǎo)致運(yùn)行時(shí)間過長;因此，我們大多數(shù)人都會保持1mL/min的流量(容許附加調(diào)整范圍為±50%)，以實(shí)現(xiàn)更短的運(yùn)行時(shí)間和合理的壓力。表2還列示了新柱相對于原柱的壓力和運(yùn)行時(shí)間的估算值。

　　美國藥典論述對粒徑變化進(jìn)行了附加詳細(xì)說明：若板數(shù)減少量不超過20%，則傳統(tǒng)LC條件(≥3μm dp)轉(zhuǎn)變?yōu)閁HPLC(<3μm dp)(反之亦然)時(shí)允許對流量作進(jìn)一步調(diào)整。只要通過系統(tǒng)適用性測試，此種方法可實(shí)現(xiàn)一定的靈活性(可能會受到其他限制)。

　　最后要注意的是，柱尺寸、粒徑和流量調(diào)整僅適用于梯度方法。雖然可針對此類變化適當(dāng)調(diào)整梯度方法，它們并未含入現(xiàn)行版美國藥典;因此，在決定調(diào)整梯度方法時(shí)必須進(jìn)行一定的再驗(yàn)證。

　　進(jìn)樣量和柱溫

　　只要作用方法正常運(yùn)行，進(jìn)樣量便可增加或減少。若要大幅增加進(jìn)樣量，一定要注意譜帶增寬過度和保留時(shí)間變化的情況。減少進(jìn)樣量時(shí)一定要確保有足夠的信號提供可接受的精確度和準(zhǔn)確度。高于和低于擬用新進(jìn)樣量進(jìn)行的多次進(jìn)樣有助于驗(yàn)證(并記錄)變化的魯棒性和適用性。

　　柱溫變化幅度為±10℃，但要記住，溫度沒變化1℃，等度保留時(shí)間就會縮短約2%。選擇性隨溫度變化而改變，特別是樣本中存在可電離化合物時(shí)。改變柱溫時(shí)務(wù)必保證樣本臨界峰的分離不受影響。

　　結(jié)論

　　正如我們所見，美國藥典為LC方法調(diào)整提供了合理的指導(dǎo)準(zhǔn)則。這些容許范圍適用于等度方法，但對于梯度方法，其可能會被禁止或不推薦使用，我會再次回到我最開始提出的問題。美國藥典指導(dǎo)準(zhǔn)則僅適用于美國藥典所包含的專著方法的調(diào)整。我們認(rèn)為指導(dǎo)準(zhǔn)則不使用于非美國藥典規(guī)定方法，因此在違反相應(yīng)規(guī)范的情況下不允許更改其他方法。最后，許多公司對美國藥典和其他規(guī)范性文件都有自己的解釋;因此，在決定調(diào)整LC方法時(shí)必須查閱內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和其他規(guī)范性指導(dǎo)。切記：“調(diào)整和更改應(yīng)以文件記錄為依據(jù)”，因此必須適當(dāng)保存相應(yīng)記錄。

【本文由LC/GC雜志供稿，作者：John W.Dolan，LC故障排查編輯】