非小細(xì)胞肺癌是最為常見的肺癌，占肺癌總數(shù)的80%，其治療前需檢測EGFR基因突變已成共識(shí)。這篇文章主要為大家介紹非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測的三個(gè)重要環(huán)節(jié)——標(biāo)本采集及處理、cfDNA的提取、EGFR突變檢測。

　　非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中EGFR基因突變狀態(tài)與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)療效預(yù)測的相關(guān)性早已被證實(shí)，NSCLC治療前需檢測EGFR基因突變也已成共識(shí)。但是在臨床實(shí)踐中，首先，多數(shù)肺癌患者確診時(shí)往往已到晚期，其中相當(dāng)部分腫瘤組織標(biāo)本難以獲取，導(dǎo)致無法進(jìn)行EGFR檢測;另外，部分患者腫瘤內(nèi)EGFR基因突變的異質(zhì)性使基于基因檢測的靶向治療決策變得更加困難;最后，我國的EGFR基因突變檢測在肺癌患者中的受檢率相對偏低，吉林腫瘤醫(yī)院程穎教授在2017 WCLC會(huì)議報(bào)告上指出：相對于歐美接近100%的檢測率，中國北方三級(jí)甲等和腫瘤醫(yī)院中，肺癌的EGFR檢測率也僅僅只有46%。因此，針對臨床實(shí)踐中腫瘤組織檢測的種種局限，探尋作為其補(bǔ)充或替代的其他生物標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測具有重要臨床意義，也有助于提高臨床患者的總體EGFR基因受檢率。

　　近些年，以血液等為樣本基礎(chǔ)的液體活檢技術(shù)飛速發(fā)展。多項(xiàng)研究表明[1-3]，大部分晚期NSCLC患者的血液中存在循環(huán)游離DNA(cfDNA)及循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA);并且已有研究顯示外周血ctDNA EGFR基因突變檢測結(jié)果對EGFR-TKIs療效有預(yù)測作用[2，4-5]。因此，當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，無創(chuàng)、易采集的血液檢測就是組織EGFR基因突變分析合適的替代選擇，并且血液檢測在一定程度上能有效克服腫瘤異質(zhì)性，可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測等。

　　標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程是保障ctDNA-EGFR血液檢測質(zhì)量的前提，臨床專家對于血液檢測應(yīng)用規(guī)范問題也多有探討，并于2015年12月8號(hào)在《中華醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表了由吳一龍、王潔等教授整理的《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因檢測中國專家共識(shí)》。其中，標(biāo)本采集及處理、cfDNA的提取、EGFR突變檢測是血液檢測的三個(gè)重要環(huán)節(jié)。

　　一、血液EGFR基因突變檢測之標(biāo)本采集及處理

　　1.患者選擇

　　研究顯示，腫瘤分期越高，ctDNA檢出率越高[6]，即III或IV期的腫瘤患者血液中的ctDNA相較Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高，更容易被檢出。因此，為提高血液EGFR檢出率，建議選擇晚期患者。

　　須知藥物治療過程中，EGFR突變情況以及ctDNA的濃度可能發(fā)生變化。如下圖所示[7]：

　　2.標(biāo)本采集及分離

　　全血中血漿和血清均能分離出ctDNA，但研究顯示，相對于血清標(biāo)本，血漿中ctDNA有更高的檢出率[8]。另外，對同一患者，血漿量越多所提取的DNA量就越多，其中含有的cfDNA量就越多，對檢測越有利[9]，如下圖所示：

　　因此按照專家共識(shí)[10]建議采集10ml全血(可分離4-5ml血漿)，采集完成后需溫柔顛倒混勻，以便于抗凝劑或保護(hù)劑充分與血液接觸。

　　此時(shí)需根據(jù)使用的采血管類型(常規(guī)EDTA抗凝管/專用常溫采血管)進(jìn)行不同的后續(xù)操作。

　　(1)：用常規(guī)EDTA抗凝管采集全血后，為防止游離DNA的降解，避免野生型DNA背景的增加，建議兩小時(shí)內(nèi)以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次[11]，分離出不含細(xì)胞成分的血漿，吸取操作如下圖所示，分離出的血漿放置于-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進(jìn)入DNA抽提步驟(備注：離心前臨時(shí)保存應(yīng)暫放于2~8℃冷藏);

　　(2)：用含有游離DNA保護(hù)劑及防細(xì)胞裂解保護(hù)劑的專用常溫采血管采集后輕搖混勻，常溫放置不超過5-7天，以足夠的離心力將全血充分離心兩次，分離出不含細(xì)胞成分的血漿，放置于-70℃凍存直至DNA抽提，或直接進(jìn)入DNA抽提步驟。如果外送運(yùn)輸全血，建議使用cfDNA專用常溫采血管。

　　禁用肝素抗凝管：由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取過程中難以去除，肝素也會(huì)導(dǎo)致PCR效率降低，因此cfDNA檢測血液采集禁用肝素抗凝管。

　　3.血漿質(zhì)量評(píng)價(jià)

　　(1)血漿是否溶血：如發(fā)生嚴(yán)重溶血，標(biāo)本不可用，血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴(kuò)增效率明顯降低。

　　(2)血脂是否過高：血脂過高，使血漿呈乳白色，低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收作用，故對PCR有干擾。

　　二、血液EGFR基因突變檢測之cfDNA提取

　　10ml全血分離出的4-5ml血漿用于cfDNA的提取，目前可用于cfDNA提取的方法很多，有實(shí)驗(yàn)室自建方法，也有商用核酸提取試劑盒。建議采用國家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的、大容量血漿游離DNA分離試劑盒。

　　所提取的cfDNA建議馬上使用，若不能立即進(jìn)行后續(xù)檢測而需要儲(chǔ)存cfDNA，首選-80℃冰箱凍存。若無-80℃冰箱，可選擇-20℃保存，應(yīng)盡可能縮短凍存時(shí)間，盡快進(jìn)行后續(xù)檢測。凍存時(shí)注意密封及標(biāo)記完整，避免反復(fù)凍融。

　　三、血液EGFR基因突變檢測

　　中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)在2015年2月批準(zhǔn)吉非替尼說明書更新，可通過血液ctDNA檢測EGFR基因突變指導(dǎo)吉非替尼治療。近期，CFDA更是通過創(chuàng)新醫(yī)療器械特別審批的方式，快速批準(zhǔn)艾德生物自主創(chuàng)新產(chǎn)品Super-ARMS? EGFR檢測試劑盒(Super-ARMS技術(shù)是在原有ADx-ARMS技術(shù)優(yōu)勢基礎(chǔ)上，優(yōu)化引物探針設(shè)計(jì)和反應(yīng)體系，將檢測靈敏度提升至0.2%，完全適用于對靈敏度要求更高的血液檢測領(lǐng)域)用于血液ctDNA-EGFR基因突變的檢測。由此可見，ctDNA-EGFR標(biāo)準(zhǔn)化檢測的時(shí)代已經(jīng)到來!

　　為了降低假陽性概率，推薦使用經(jīng)國家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的高敏感度的檢測方法用于ctDNA樣本的EGFR基因突變檢測。專家共識(shí)中也指出，檢測必須在具有資質(zhì)的檢測中心進(jìn)行。檢測方法必須進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證及質(zhì)控。檢測試劑須使用經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的檢測試劑盒。目前，檢測基因突變最常用的方法是擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)(ARMS法)，歐盟批準(zhǔn)用于指導(dǎo)吉非替尼治療的血液檢測方法也是ARMS檢測方法。而Super-ARMS?方法是CFDA批準(zhǔn)用于血漿中EGFR突變檢測的敏感度最高的ARMS方法，其檢測靈敏度可達(dá)0.2%。

　　根據(jù)今年ESMO(歐洲臨床腫瘤協(xié)會(huì)年會(huì))大會(huì)上，上海肺科醫(yī)院周彩存教授、廣東省人民醫(yī)院吳一龍教授等多位肺癌權(quán)威專家共同發(fā)布的AURA 17擴(kuò)展研究數(shù)據(jù)可知[12]，Super-ARMS? 技術(shù)檢測血漿T790M突變的陽性檢出率僅次于目前靈敏度最高的ddPCR技術(shù)，更重要的是，Super-ARMS?技術(shù)檢出的血液T790M突變陽性患者服務(wù)奧希替尼的客觀響應(yīng)率(ORR)最高，高達(dá)64%，說明靈敏度0.2%的Super-ARMS?技術(shù)是臨床血液ctDNA檢測的最優(yōu)選擇，療效預(yù)測的準(zhǔn)確性最高，是血液檢測臨床應(yīng)用的可靠技術(shù)。

　　總之，血液EGFR突變檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、合規(guī)化是保證檢測準(zhǔn)確率的核心，在減少操作流程對檢測結(jié)果影響的前提下，選擇經(jīng)國家藥監(jiān)部門嚴(yán)格審批上市的檢測產(chǎn)品和合規(guī)專業(yè)的檢測機(jī)構(gòu)也是至關(guān)重要的。