非小細(xì)胞肺癌是最為常見的肺癌,占肺癌總數(shù)的80%,其治療前需檢測EGFR基因突變已成共識(shí)。這篇文章主要為大家介紹非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測的三個(gè)重要環(huán)節(jié)——標(biāo)本采集及處理、cfDNA的提取、EGFR突變檢測。
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中EGFR基因突變狀態(tài)與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)療效預(yù)測的相關(guān)性早已被證實(shí),NSCLC治療前需檢測EGFR基因突變也已成共識(shí)。但是在臨床實(shí)踐中,首先,多數(shù)肺癌患者確診時(shí)往往已到晚期,其中相當(dāng)部分腫瘤組織標(biāo)本難以獲取,導(dǎo)致無法進(jìn)行EGFR檢測;另外,部分患者腫瘤內(nèi)EGFR基因突變的異質(zhì)性使基于基因檢測的靶向治療決策變得更加困難;最后,我國的EGFR基因突變檢測在肺癌患者中的受檢率相對偏低,吉林腫瘤醫(yī)院程穎教授在2017 WCLC會(huì)議報(bào)告上指出:相對于歐美接近100%的檢測率,中國北方三級(jí)甲等和腫瘤醫(yī)院中,肺癌的EGFR檢測率也僅僅只有46%。因此,針對臨床實(shí)踐中腫瘤組織檢測的種種局限,探尋作為其補(bǔ)充或替代的其他生物標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測具有重要臨床意義,也有助于提高臨床患者的總體EGFR基因受檢率。
近些年,以血液等為樣本基礎(chǔ)的液體活檢技術(shù)飛速發(fā)展。多項(xiàng)研究表明[1-3],大部分晚期NSCLC患者的血液中存在循環(huán)游離DNA(cfDNA)及循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA);并且已有研究顯示外周血ctDNA EGFR基因突變檢測結(jié)果對EGFR-TKIs療效有預(yù)測作用[2,4-5]。因此,當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí),無創(chuàng)、易采集的血液檢測就是組織EGFR基因突變分析合適的替代選擇,并且血液檢測在一定程度上能有效克服腫瘤異質(zhì)性,可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測等。
標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程是保障ctDNA-EGFR血液檢測質(zhì)量的前提,臨床專家對于血液檢測應(yīng)用規(guī)范問題也多有探討,并于2015年12月8號(hào)在《中華醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表了由吳一龍、王潔等教授整理的《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因檢測中國專家共識(shí)》。其中,標(biāo)本采集及處理、cfDNA的提取、EGFR突變檢測是血液檢測的三個(gè)重要環(huán)節(jié)。
一、血液EGFR基因突變檢測之標(biāo)本采集及處理
1.患者選擇
研究顯示,腫瘤分期越高,ctDNA檢出率越高[6],即III或IV期的腫瘤患者血液中的ctDNA相較Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高,更容易被檢出。因此,為提高血液EGFR檢出率,建議選擇晚期患者。
須知藥物治療過程中,EGFR突變情況以及ctDNA的濃度可能發(fā)生變化。如下圖所示[7]:
2.標(biāo)本采集及分離
全血中血漿和血清均能分離出ctDNA,但研究顯示,相對于血清標(biāo)本,血漿中ctDNA有更高的檢出率[8]。另外,對同一患者,血漿量越多所提取的DNA量就越多,其中含有的cfDNA量就越多,對檢測越有利[9],如下圖所示:
因此按照專家共識(shí)[10]建議采集10ml全血(可分離4-5ml血漿),采集完成后需溫柔顛倒混勻,以便于抗凝劑或保護(hù)劑充分與血液接觸。
此時(shí)需根據(jù)使用的采血管類型(常規(guī)EDTA抗凝管/專用常溫采血管)進(jìn)行不同的后續(xù)操作。
(1):用常規(guī)EDTA抗凝管采集全血后,為防止游離DNA的降解,避免野生型DNA背景的增加,建議兩小時(shí)內(nèi)以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次[11],分離出不含細(xì)胞成分的血漿,吸取操作如下圖所示,分離出的血漿放置于-70℃凍存直至DNA抽提,或直接進(jìn)入DNA抽提步驟(備注:離心前臨時(shí)保存應(yīng)暫放于2~8℃冷藏);
(2):用含有游離DNA保護(hù)劑及防細(xì)胞裂解保護(hù)劑的專用常溫采血管采集后輕搖混勻,常溫放置不超過5-7天,以足夠的離心力將全血充分離心兩次,分離出不含細(xì)胞成分的血漿,放置于-70℃凍存直至DNA抽提,或直接進(jìn)入DNA抽提步驟。如果外送運(yùn)輸全血,建議使用cfDNA專用常溫采血管。
禁用肝素抗凝管:由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取過程中難以去除,肝素也會(huì)導(dǎo)致PCR效率降低,因此cfDNA檢測血液采集禁用肝素抗凝管。
3.血漿質(zhì)量評(píng)價(jià)
(1)血漿是否溶血:如發(fā)生嚴(yán)重溶血,標(biāo)本不可用,血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性,使PCR擴(kuò)增效率明顯降低。
(2)血脂是否過高:血脂過高,使血漿呈乳白色,低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收作用,故對PCR有干擾。
二、血液EGFR基因突變檢測之cfDNA提取
10ml全血分離出的4-5ml血漿用于cfDNA的提取,目前可用于cfDNA提取的方法很多,有實(shí)驗(yàn)室自建方法,也有商用核酸提取試劑盒。建議采用國家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的、大容量血漿游離DNA分離試劑盒。
所提取的cfDNA建議馬上使用,若不能立即進(jìn)行后續(xù)檢測而需要儲(chǔ)存cfDNA,首選-80℃冰箱凍存。若無-80℃冰箱,可選擇-20℃保存,應(yīng)盡可能縮短凍存時(shí)間,盡快進(jìn)行后續(xù)檢測。凍存時(shí)注意密封及標(biāo)記完整,避免反復(fù)凍融。
三、血液EGFR基因突變檢測
中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)在2015年2月批準(zhǔn)吉非替尼說明書更新,可通過血液ctDNA檢測EGFR基因突變指導(dǎo)吉非替尼治療。近期,CFDA更是通過創(chuàng)新醫(yī)療器械特別審批的方式,快速批準(zhǔn)艾德生物自主創(chuàng)新產(chǎn)品Super-ARMS? EGFR檢測試劑盒(Super-ARMS技術(shù)是在原有ADx-ARMS技術(shù)優(yōu)勢基礎(chǔ)上,優(yōu)化引物探針設(shè)計(jì)和反應(yīng)體系,將檢測靈敏度提升至0.2%,完全適用于對靈敏度要求更高的血液檢測領(lǐng)域)用于血液ctDNA-EGFR基因突變的檢測。由此可見,ctDNA-EGFR標(biāo)準(zhǔn)化檢測的時(shí)代已經(jīng)到來!
為了降低假陽性概率,推薦使用經(jīng)國家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的高敏感度的檢測方法用于ctDNA樣本的EGFR基因突變檢測。專家共識(shí)中也指出,檢測必須在具有資質(zhì)的檢測中心進(jìn)行。檢測方法必須進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證及質(zhì)控。檢測試劑須使用經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的檢測試劑盒。目前,檢測基因突變最常用的方法是擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)(ARMS法),歐盟批準(zhǔn)用于指導(dǎo)吉非替尼治療的血液檢測方法也是ARMS檢測方法。而Super-ARMS?方法是CFDA批準(zhǔn)用于血漿中EGFR突變檢測的敏感度最高的ARMS方法,其檢測靈敏度可達(dá)0.2%。
根據(jù)今年ESMO(歐洲臨床腫瘤協(xié)會(huì)年會(huì))大會(huì)上,上海肺科醫(yī)院周彩存教授、廣東省人民醫(yī)院吳一龍教授等多位肺癌權(quán)威專家共同發(fā)布的AURA 17擴(kuò)展研究數(shù)據(jù)可知[12],Super-ARMS? 技術(shù)檢測血漿T790M突變的陽性檢出率僅次于目前靈敏度最高的ddPCR技術(shù),更重要的是,Super-ARMS?技術(shù)檢出的血液T790M突變陽性患者服務(wù)奧希替尼的客觀響應(yīng)率(ORR)最高,高達(dá)64%,說明靈敏度0.2%的Super-ARMS?技術(shù)是臨床血液ctDNA檢測的最優(yōu)選擇,療效預(yù)測的準(zhǔn)確性最高,是血液檢測臨床應(yīng)用的可靠技術(shù)。
總之,血液EGFR突變檢測的標(biāo)準(zhǔn)化、合規(guī)化是保證檢測準(zhǔn)確率的核心,在減少操作流程對檢測結(jié)果影響的前提下,選擇經(jīng)國家藥監(jiān)部門嚴(yán)格審批上市的檢測產(chǎn)品和合規(guī)專業(yè)的檢測機(jī)構(gòu)也是至關(guān)重要的。