過去十年間有超過100個新的生物藥物獲批上市，這些新上市的生物藥物中大部分是利用真核生物表達系統(tǒng)表達的重組蛋白，而這些重組蛋白多數是糖蛋白，如單克隆抗體、融合蛋白、生長因子等。由于糖基化會影響糖蛋白藥物的安全性和有效性，因此對糖基化的詳細表征是糖蛋白藥物質量分析和控制必不可少的，并且藥品監(jiān)管機構對糖基化分析法的穩(wěn)定性也有嚴格的要求。因此建立一個能夠自動化并且可靠的糖基化分析流程一直是藥物研發(fā)人員面臨的挑戰(zhàn)。

基于熒光標記的定量方法作為Released Glycans（游離糖苷）定量分析的金標準，已經廣泛應用于單克隆抗體藥物工藝開發(fā)中的質量監(jiān)控和最終產品的質量控制，但這種基于保留時間的分析方法對于一些糖基化比較復雜的樣本就顯示出專屬性不足的缺點，為此，測定糖苷的精確質量數作為補充手段來提高分析的專屬性，但即使這樣還不足以將復雜的樣品中所有糖苷進行100%確定地注釋。為了應對這個挑戰(zhàn)，Glycotope公司和布魯克合作開發(fā)了一個專門用于Released Glycans分析的工作流程（圖1），此工作流程通過GlycoFiler軟件將布魯克高分辨QTOF獲得的數據與UPLC產生的熒光色譜圖結合，提供一個自動化的并且可靠的糖基化定性和定量分析流程。

▲圖1. GlycoFiler游離糖苷分析流程

數據處理和報告生成高度自動化

Released Glycans樣品經過UPLC-FLR-QTOF分析完成數據采集后，GLycoFiler可以分別對熒光色譜圖進行自動積分得到每個峰的峰面積，對MS/MS數據進行自動的搜庫得到糖苷的結構信息，整個搜庫過程只需要5 min即可完成，然后將糖苷結構與對應的熒光色譜峰相關聯，即完成了糖苷的定性和相對定量分析（圖2）。此工作流程的自動化報告功能（圖3）也非常強大，除了能報告最終的結構鑒定和定量結果外，還可以按照糖基化的類型（如唾液酸，核心巖藻糖，高苷露糖等）分別進行統(tǒng)計，同時還可以做不同批次間的比較分析。

▲圖2. 2-AB標記糖苷分析示例

▲圖3. GlycoFiler報告模塊

糖苷結構鑒定和數據注釋高度可靠

目前糖基化鑒定分析多基于液相的保留時間（如GU值）和一級精確質量，對于糖基化相對比較簡單的單克隆抗體樣本來說可能夠用，但對于一些糖基化比較復雜的樣本（如整合蛋白，多糖基化位點的單克隆抗體，血因子等），鑒定結果的可靠性就大大降低，而布魯克和GlycoTope公司聯合推出的糖基化分析方案，是基于MS/MS數據進行糖苷譜圖庫（圖4）的檢索而鑒定糖苷結構。內置的糖苷譜圖庫包含大于750個糖苷實驗質譜圖（糖苷的MS和MS/MS譜圖），涵蓋大于15個細胞系的25種糖蛋白，支持2-AB標記和RapiFlour標記。

▲圖4. GlycoFiler糖苷譜圖庫特點

加快糖蛋白藥物研發(fā)的進程

布魯克和GlycoTope公司聯合推出的Released Glycans分析方案，可以廣泛應用于藥物研發(fā)早期蛋白與配體相互作用研究，生物工藝過程中克隆篩選、細胞系的開發(fā)和發(fā)酵工藝的開發(fā)，產品的表征和質量控制，產品放行測試。此分析方案的高度自動化和高度可靠的特點，必將加快糖基化分析的速度和質量控制的可靠性，從而加速糖蛋白藥物開發(fā)的進程。

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