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? ??圖 ?ORC通過彎曲DNA來進一步加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7的過程模式圖

? ? 在國家自然科學(xué)基金項目(項目批準(zhǔn)號：31761163004、31725007、31630087)等資助下，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高寧教授課題組與香港科技大學(xué)戴碧瓘教授課題組合作，解析了釀酒酵母ORC結(jié)合DNA復(fù)制起始位點3-?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。研究成果以 “Structure of the Origin Recognition Complex Bound to DNA Replication Origin”(結(jié)合有復(fù)制起點DNA的起點識別復(fù)合物結(jié)構(gòu))為題，于2018年7月4日以長文(Article)形式在Nature(《自然》)上發(fā)表。北京大學(xué)高寧教授和香港科技大學(xué)戴碧瓘教授、翟元樑博士為共同通訊作者。高寧課題組博士后李寧寧、博士生程稼萱以及戴碧瓘組博士后林偉熙、翟元樑為共同第一作者。

? ? DNA復(fù)制起始在真核生物細(xì)胞中受到嚴(yán)格而精密的調(diào)控。DNA復(fù)制啟動因子(ORC，Origin Recognition Complex)首先結(jié)合到DNA復(fù)制起點，以加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7復(fù)合物到DNA上，隨后MCM2-7被激活，DNA雙鏈被解螺旋，從而啟動DNA復(fù)制。所有真核生物都是利用由6個亞基組成的ORC來標(biāo)記DNA復(fù)制起始的位點，在維持基因組穩(wěn)定性過程中的重要作用，其功能缺失突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。

? ? 雖然在不同的真核生物中，ORC的蛋白質(zhì)序列高度保守，但是ORC對DNA復(fù)制起點序列的選擇性在不同物種間差別很大。釀酒酵母的ORC可以識別特異的DNA復(fù)制起點，而人源細(xì)胞ORC結(jié)合的DNA序列卻沒有序列特異性，主要依賴染色體結(jié)構(gòu)識別復(fù)制起點。而由于一直缺少ORC結(jié)合DNA狀態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)，ORC序列識別差異背后的分子機制長期以來難以解釋。

? ? 高寧研究員課題組解析的3-?分辨率ORC-ARS305 DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ARS305包含一段ARS高度保守序列(ARS Consensus Sequence, ACS)和一段B1元件序列，長度為72 bp。在這個結(jié)構(gòu)中，ORC的六個亞基通過與磷酸骨架的非特異性以及與堿基的特異性相互作用環(huán)繞DNA，并在ACS和B1位點使DNA發(fā)生彎曲。該結(jié)構(gòu)的一個關(guān)鍵特征是Orc1的保守堿性氨基酸區(qū)域(Orc1-BP，basic patch)深深地插入ACS的小溝中進行序列特異的堿基識別。另外，酵母特有的具有物種特異性的位于Orc4 Wing Helix結(jié)構(gòu)域(WHD)中的Helix Insertion(Orc4-IH)嵌入ACS的大溝中，與相應(yīng)的堿基形成疏水相互作用。更重要的是，在ACS區(qū)域形成的這些堿基特異的相互作用的堿基都非常保守。此外，在B1區(qū)域中，也有類似的來自O(shè)rc2和Orc5的堿性氨基酸區(qū)域插入到大溝和小溝中，與堿基相互作用，并使DNA彎曲。因此，釀酒酵母ORC高度序列特異性主要是通過ORC亞基的大溝、小溝插入基序與ACS保守堿基之間的特異性相互作用實現(xiàn)的。序列比對分析顯示，所有真核生物Orc1的N端都具有類似釀酒酵母的Orc1-BP;然而Orc4-IH卻只在釀酒酵母中存在。這些發(fā)現(xiàn)，很大程度上解釋了不同物種ORC識別起始DNA特異性差異背后的原因。

? ? 此高分辨率結(jié)構(gòu)不僅為理解酵母ORC如何識別和結(jié)合序列特異性的DNA復(fù)制起點提供了分子基礎(chǔ)，同時也從分子機制角度闡明了ORC如何通過彎曲DNA來進一步加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7的過程。