1.介紹

沙星類（Quinones，QNs）抗生素（圖-1）是一類人工合成的新型殺菌性抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性以及毒副作用小、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，被大量用于治療和預(yù)防水生動(dòng)物疾病及促生長(zhǎng)。但研究表明，所使用的抗生素僅20%～30%被魚類吸收，大部分進(jìn)入環(huán)境中，而這部分抗生素再次進(jìn)入食物鏈，可能導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中病菌耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致二次污染。這不僅影響到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且還威脅著生態(tài)環(huán)境的安全。水樣中殘留喹諾酮類抗生素，通過(guò)飲用進(jìn)入人體，可能對(duì)人體肝臟功能造成嚴(yán)重?fù)p傷。因此，建立水環(huán)境中這類藥物的檢測(cè)方法尤為重要。目前，喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)方法，主要包括HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS，另外還有熒光光譜法、毛細(xì)管電泳法和酶聯(lián)免疫法等。

圖-1. 16種沙星類抗生素的結(jié)構(gòu)式

本實(shí)驗(yàn)選擇MCX陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行富集、凈化，超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)，建立了環(huán)境水樣中高靈敏的分析方法，該方法有望應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

關(guān)鍵字：全自動(dòng)固相萃?。桓咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜；抗生素

2.儀器、試劑以及耗材

Reeko Fotector Plus全自動(dòng)固相萃取儀（?？疲?p>MCX 固相萃取柱（Oasis，200 mg/6 mL）

高效液相色譜：（HPLC）Agilent 1260，質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）Agilent 6410

氮?dú)獯蹈裳b置：Reeko AutoEVA-60全自動(dòng)平行濃縮儀

甲醇，乙腈（TEDIA 色譜純）；甲酸，氨水（優(yōu)級(jí)純）

3.樣品制備與凈化

3.1 固相萃取凈化條件

全自動(dòng)固相萃取儀?？艶otector Plus 60位固相萃取柱MCX（Waters，200 mg/6 mL）活化甲醇淋洗pH=4.0 的甲酸水溶液洗脫5%的氨水甲醇溶液

3.2 富集凈化

依次用甲醇（10mL）和水（10mL）以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，備用。取純凈水樣200mL，如為加標(biāo)樣品，請(qǐng)加入標(biāo)準(zhǔn)品（100 μL，100 ppb），加入EDTA-MCIlvaine緩沖溶劑（50mL，0.1 mol/L）調(diào)節(jié)水環(huán)境的pH為4，以5mL/min的速率經(jīng)固相萃取小柱富集后；用甲酸水溶液（pH=4.0）10 mL以10 mL/min速率淋洗；氣推后用10 mL的5%氨水甲醇以1.0mL/min的速率洗脫。收集的樣品在25 ℃，5 psi條件下濃縮至近干，流動(dòng)相乙腈-水溶液（10：90，v/v，0.1 %甲酸）定容至1.0mL，供LC/MS-MS分析。全自動(dòng)固相萃取方法見(jiàn)圖-2。

圖-2. Fotector Plus水中沙星抗生素固相萃取方法

4.液質(zhì)檢測(cè)條件

4.1 色譜柱條件

4.2 MRM參數(shù)

表-1. 16種抗生素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

4.3 16種沙星類抗生素的保留時(shí)間譜圖

5.樣品測(cè)試

5.1基質(zhì)效應(yīng)驗(yàn)證

取純凈水樣，按照上述的樣品處理步驟后，氮吹至近干，加入標(biāo)準(zhǔn)使用液（1ppm，20 μL），定容成1mL，供LC/MS-MS檢測(cè)。如果基質(zhì)加標(biāo)濃度準(zhǔn)確，則可以直接用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量；如果不準(zhǔn)確，請(qǐng)使用含有基質(zhì)的工作曲線進(jìn)行定量。

選擇定量離子的峰面積作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)，做相關(guān)曲線，曲線為線性回歸，各點(diǎn)權(quán)重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99；此曲線兩周需要重新配置一次。

5.2 樣品基質(zhì)加標(biāo)測(cè)試

對(duì)桶裝純凈水和生活廢水進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為低濃度（25 ng/L）、中濃度（50 ng/L）和高濃度（100 ng/L），結(jié)果如表-2所示：除了恩諾沙星和司帕沙星在76.9%~79.4%外，大部分的加標(biāo)回收率在82.5%~114.2 %之間，RSD 1.5%~16.6%。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)水樣中16種喹諾酮抗生素進(jìn)行檢測(cè)。

表-2 不同水樣的加標(biāo)回收率

5.3 不同類型固相萃取柱對(duì)沙星類化合物的富集效果

取純凈水為樣品，加標(biāo)的質(zhì)量濃度分別為50 ng/L，按照上述方法，進(jìn)行4平行樣測(cè)定，考察該方法的不同固相萃取柱的回收率和重現(xiàn)性，分析結(jié)果如圖-4所示：純凈水中抗生素的平均回收率分布在65.00%-91.38%（HLB），71.21%-152.28%（MAX）和77.41 % -123.21 %（MCX）。HLB回收率普遍偏低，MAX柱中沙星的回收率偏高，培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超過(guò)了140 %，而且MAX柱需要在水樣中加入氫氧化鈉，容易造成水樣中金屬離子的水解沉淀，容易造成管路的堵塞。相比之下MCX柱的平行性比HLB柱和MAX好，回收率大部分在90 %-110%之間，除了恩諾沙星回收率偏低，只有77.41 %。

圖-4. 三種柱子的回收率對(duì)比

6.結(jié)果與討論

6.1 對(duì)于16種沙星類化合物在水中的富集方法，應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基質(zhì)對(duì)化合物檢測(cè)的干擾。此步的干擾不僅來(lái)自于水樣中雜質(zhì)干擾，同時(shí)商業(yè)化的固相萃取小柱，使用的色譜級(jí)溶液等等都存在干擾雜質(zhì)，因此需要進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)確認(rèn)，以避免前處理富集過(guò)程中存在基質(zhì)效應(yīng)。

6.2 氮吹濃縮過(guò)程中應(yīng)控制吹干程度，不可過(guò)分干燥。

6.3 對(duì)于沙星類的兩性化合物，在pH=7.0左右時(shí)，主要以帶負(fù)電荷的形式存在水溶液中，此時(shí)進(jìn)行富集，固相小柱無(wú)法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行吸附。因此需要進(jìn)行pH調(diào)節(jié)至4.0左右，使其成為帶銨根的正離子，利于下一步進(jìn)行陽(yáng)離子交換柱富集。

6.4 淋洗時(shí)采用甲酸酸化的水溶液，利于將固相萃取小柱中殘留的EDTA除去，避免其在后續(xù)的洗脫液中干擾沙星類化合物的檢測(cè)。