檢驗技術：石蠟切片的酶免疫組化注意事項！

一、石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？

一般來說，如果用多聚賴氨酸包被過的片子做正常免疫組織化學染色的話是不會掉片子的。但如果要做抗原修復的話，如果片子處理不好的話是有可能掉片子的。你可以試試一下的方法：

1、一般用APES：丙酮=1:50的處理液來處理片子，處理5min左右，然后水洗，烘干既可用于貼片。如果把水滴再處理好的片子上，水比較聚的話說明片子處理的好。

2、貼片子的時候，展片的時間要把握好，不要太長，否則不利于貼牢。

3、烤片子也很重要，切好的片子先不要馬上收起來，而是水平至于烘片臺上37度兩個小時以上，一是水分徹底烘干。然后做染色前再在60度烘箱烘1個小時。

4、再補充一點 ，石蠟包埋時，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點要充分，這對貼片也有影響。

如果這些導致掉片的因素都已經排除但是片子還是掉的厲害，那么也可能是以下原因造成的：

1、多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。

2、組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

3、組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

4、沒烤好，時間短溫度不夠之類。

5、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

6、修復的問題：抗原修復的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

二、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關系，可能原因有：

1、切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

2、有可能是你 顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。

3、如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產生了邊緣效應。最外側的組織片離顯色液外緣0.5cm。

三、切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？

a.也許是抗體本身有問題，因為有很多公司的抗體質量并不好，很容易上背景，可以換一種抗體試試。

b.如果經費不允許換抗體的話，你可降低抗體的濃度，并隨時注意觀察顯色，在能看到信號的情況下盡量降低背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對某種來源的抗體來說，會有不同的封閉效果。

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測動物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。

全片著色

全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結果進行調整。

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會 游離出 氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達到 理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。

（4）組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組 化染 色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4?C冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太 長。

（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

四、免疫組化結果老是出現(xiàn)陰性結果？

免疫組化出現(xiàn)陰性結果有可能組織本身就沒有信號，也有可能是抗體出了問題?？梢哉乙恍╆栃越M織做一下，以確定是抗體的問題還是組織本身就沒有所檢測的抗原表達。還有，可以提高抗體的濃度，或者試一試抗原修復等方法，也許會得到意想不到的結果。

五、一抗從4度拿出后，為什么有人說要37度復溫，目的是什么？

1、一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

2、另一方面，使抗原抗體結合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

六、免疫組化中抗原修復的條件是什么？尤其是微波修復。

關于抗原修復，我個人的觀點和panther75有點不同。我試過的修復條件有EDTA熱修復，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復以及高壓鍋修復。從我的實驗結果 來看，微波修復其實很不容易掉片子的，而EDTA熱修復和高壓鍋修復是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產生的氣泡所引起，而微波修復水加 熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修復時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的，然后蓋 上蓋玻片，這樣修復的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。

我們用的微波修復條件為：2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水，調ph值至6.0，微波修復10分鐘。你可以試試，時間可以根據(jù)需要自己調整。

七、有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細胞，對石蠟切片需要否？

用石蠟切片做免疫組化是不需要透膜處理的，一是因為石蠟切片比較薄，另外一個原因我認為是在包埋過程中細胞膜已經被破壞，所以這一步可以省略。

八、蘇木素復染的時間應該是多少？復染過度咋辦？

復染時間不需要太長，當然這也要根據(jù)蘇木精的質量來確定，但基本上不要超多一分鐘。染色過深的話可以用酸性的水溶液（在水里滴加少量濃鹽酸）分色，分色的另 外一個目的是洗掉蘇木精在細胞質中的非特異性結合，這樣可以使細胞質中的特異信號更明顯。所以不管復染是不是過度，分色這一步不要省掉。分色后記得再 用氨水返藍一下。

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