CD47試劑盒；人CD47分子(CD47)ELISA試劑盒

適用于人血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

檢測原理：

       ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗人CD47單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人CD47會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗人CD47抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的人CD47發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強(qiáng)度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的人CD47，則HRP會使無色TMB變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的人CD47濃度與OD成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中人CD47的濃度。

原理圖：


注意事項：
1.試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應(yīng)保存在2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復(fù)30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5.為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8.為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
試劑盒組成及儲存：

試劑盒組成

48孔配置

96孔配置

保存

說明書

1份

1份

封板膜

2片

2片

密封袋

1個

1個

酶標(biāo)包被板

1×48

1×96

2-8℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品

0.3ml×6管

0.3ml×6管

2-8℃保存

酶標(biāo)試劑

5 ml×1瓶

10 ml×1瓶

2-8℃保存

樣品稀釋液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

顯色劑A液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

顯色劑B液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

終止液

3 ml×1瓶

6 ml×1瓶

2-8℃保存

20×濃縮洗滌液

15ml×1瓶

25ml×1瓶

2-8℃保存

自備實驗器材（不提供，可代購）
1．酶標(biāo)儀（主波長450nm，參考波長630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機(jī)或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管


樣本收集及儲存：
1.細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在4℃條件下1000 ×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準(zhǔn)備：
1.試劑回溫：首先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋例如： 2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、pg/ml進(jìn)行稀釋，2000pg/ml為標(biāo)準(zhǔn)曲線高點濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。


4.生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5.酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

6.洗滌方法：
自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔，注與吸出間隔為30秒，洗板5次。
手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。

檢測步驟：

實驗前30 min拿出試劑盒，恢復(fù)至室溫，加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本前，請洗板3次并甩干

↓

加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品及檢測樣本到反應(yīng)孔中，封板后于37℃孵箱孵育90min

↓

加入100ul生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min

↓

加入100ul酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min

↓

加入100ul顯色底物至反應(yīng)孔中，封板后于37℃孵箱孵育15min

↓

加入50ul終止液，即刻用酶標(biāo)儀450nm波長下測量OD值（5分鐘內(nèi)）

結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。
2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均OD值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中CD47含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。
參數(shù)表征：

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml）

OD值1

OD值2

平均值

矯正值

0

0.034

0.036

0.035

---

31.25

0.072

0.077

0.075

0.040

62.5

0.101

0.106

0.104

0.069

125

0.176

0.169

0.173

0.138

250

0.344

0.326

0.335

0.300

500

0.592

0.554

0.573

0.538

1000

1.293

1.078

1.186

1.151

2000

2.187

2.259

2.223

2.188

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

應(yīng)以當(dāng)次試驗標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算人CD47的樣本含量。

2. 靈敏度：
低可檢測人CD47濃度達(dá)16pg/ml，
20個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度OD的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與人BMP-1，Collagen II，Collagen III α1，Collagen XXIII α1，Mrc2等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù) 10%。

5. 回收率：
在選取的健康人血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的人CD47，計算回收率。

樣本類型

平均回收率（%）

范圍（%）

血漿

97

92-102

細(xì)胞培養(yǎng)上清

98

94-102

6. 線性稀釋：
分別在選取的4份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人CD47，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性。

稀釋比例

回收率（%）

血漿

細(xì)胞培養(yǎng)上清

1：2

平均收率（%）

96

97

范圍（%）

94-100

93-101

1：4

平均收率（%）

97

98

范圍（%）

94-100

93-103

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