2020年11月，廣東省微生物研究所許玫英與楊永剛研究員團隊在期刊《Appl Environ Microbiol》上發(fā)表文章“Visualizing and isolating iron-reducing microorganisms at single cell level”，論文第一作者為助理研究員甘翠芬。該論文在線后被環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域著名專家DR Lovley教授評為“One of the most exciting papers in microbial iron reduction of 2020 ”

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一、研究背景

在自然環(huán)境中，鐵還原是細菌胞外電子傳遞的主要形式之一。鐵還原菌（FeRM）不僅在礦物和腐殖質(zhì)的還原中起關(guān)鍵作用，而且還參與硫化合物和有機物的氧化。此外，F(xiàn)eRM在廢水處理、生物修復(fù)和生物電化學(xué)系統(tǒng)等許多工程過程中至關(guān)重要。鐵還原菌在系統(tǒng)發(fā)育上普遍存在，目前還沒有合適的16S rRNA或基于功能基因的檢測方法對其進行檢測。本文章作者合成了一種對Fe2+具有高靈敏度和選擇性的耗氧Fe2+特異性熒光化學(xué)探針（FSFC）。該FSFC可以從純培養(yǎng)、不同細菌共培養(yǎng)或含沉積物樣品中選擇性地鑒定和定位活性FeRM。FSFC的熒光強度可以作為細菌培養(yǎng)物中Fe2+濃度的指標(biāo)。與單細胞分選技術(shù)相結(jié)合，該探針可以幫助從豐富的沉積物群落中識別和分離FeRM。

二、實驗設(shè)計

首先作者設(shè)計合成了一種對Fe2+具有高靈敏性和選擇性的特異性熒光探針（FSFC），F(xiàn)SFC能夠定位和鑒定具有活性的FeRM，其熒光強度能夠作為細菌培養(yǎng)物中Fe2+濃度指示。將FSFC熒光探針與單細胞分選技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)可視化識別和分選鐵還原菌。

三、結(jié)果與討論

1. FSFC的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性

由于碲原子對萘二甲酰亞胺熒光團的重原子作用，在沒有Fe2+的情況下，F(xiàn)SFC是非熒光的，F(xiàn)e2+可以觸發(fā)FSFC的脫氫反應(yīng)并引起強烈的熒光，研究表明不同濃度Fe+對FSFC熒光強度具有影響，并且熒光強度與Fe2+濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，因此，對于大多數(shù)環(huán)境和實驗樣品，F(xiàn)SFC可以作為Fe2+或鐵還原菌的指示劑。接下來作者驗證FSFC的選擇性，實際環(huán)境中其他金屬離子可能會影響FSFC對Fe2+的熒光影響，通過實驗表明所有被測金屬分別對FSFC沒有顯著的影響效應(yīng)。并且穩(wěn)定性測試實驗表明FSFC在5h內(nèi)保持較好的穩(wěn)定性，優(yōu)于經(jīng)典的鄰菲羅啉法。

Fig.1 FSFC對Fe2+溶液中的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性。(A) FSFC熒光光譜對不同濃度Fe2+的響應(yīng)。(B) Fe2+濃度與熒光強度FI的關(guān)系為對數(shù)關(guān)系。(C) FSFC對Fe2+的選擇性測試。(D) FSFC與傳統(tǒng)鄰菲羅啉法的相對穩(wěn)定性。

2. 活性FeRM還原可溶性和固態(tài)Fe3+的熒光成像。

前人的研究已經(jīng)廣泛證實了Shewanella和Geobacter的還鐵能力。此外，有報道稱，在用FeRM法還原鐵的過程中，磷酸亞鐵和碳酸亞鐵在細胞表面聚集。實驗結(jié)果表明與非鐵還原菌相比S12和MR-1細菌表面的Fe2+濃度高很多。使用S. decolorationis S12、S. oneidensis MR-1、G. sulfurreducens PCA三種模式鐵還原菌進行可溶性檸檬酸鐵還原時發(fā)現(xiàn)細胞熒光強度與二價鐵濃度呈良好的線性關(guān)系（圖2 A-E, G）。

Fe在自然界中主要以固體的形式存在，本研究發(fā)現(xiàn)上述模式菌在還原無定形水鐵礦的過程中的Fe2+濃度也與熒光強度呈一致性變化趨勢。值得關(guān)注的是，在用于Geobacter無定形鐵還原測試時，僅有接觸鐵顆粒的細胞呈現(xiàn)熒光，而未接觸鐵顆粒的細胞幾乎無熒光（圖2F），與該菌依賴直接接觸的鐵還原方式一致，表明FSFC具有判斷細菌細胞是否正在進行鐵還原的能力。

Fig.2 FSFC在氧、可溶性Fe3+或固態(tài)Fe3+為電子受體的情況下對菌株P(guān)CA的熒光響應(yīng)。

3. 評價不同細菌的鐵還原能力。

除鐵還原能力外，不同屬細菌通常具有不同的形狀、表面性質(zhì)和代謝物，這些都可能影響FSFC的熒光。為了進一步分析FSFC的選擇性，我們使用FSFC對5個盲菌標(biāo)本進行了檢測。從沉積物中分離出五種還原鐵性能未知的細菌。

實驗表明，與預(yù)期的結(jié)果一樣， S12和 MR-1顯示熒光，陰性對照無熒光。在5個盲樣細菌中，只有P. motobuensis Iβ12有熒光，但FI低于S12。其余細菌均無熒光(圖4A-G)，所以不同細菌的貼還原能力差異較大，且FSFC探針對不同菌的評價結(jié)果與經(jīng)典鄰菲羅啉法一致。

 Fig.4：FSFC對含有檸檬酸鐵的不同細菌培養(yǎng)物的熒光圖像。 (A) Ciceribacter sp. F217, (B) S. hydrophobicum C1, (C) Bacillus Iβ8, (D) L. varians GY32, (E) P. motobuensis Iβ12, (F) S. decolorationis S12, (G)基于鄰菲羅啉法的不同菌株的鐵還原測定。

4. FeRM與其他細菌共培養(yǎng)

FeRM和與其他功能的細菌共培養(yǎng)是了解FeRM與其他細菌之間相互作用的重要方法。

為了測試FSFC是否可以在共培養(yǎng)系統(tǒng)中鑒定出FeRM，作者使用乳酸作為電子供體共培養(yǎng)了絲狀非FeRM 菌株GY32和桿狀菌株S12。如圖5A所示，桿狀菌株S12顯示出強熒光，而絲狀細菌GY32在相同的鐵還原培養(yǎng)物中沒有熒光?？梢钥闯?，F(xiàn)SFC可以選擇性地選擇微生物樣品中的FeRM。為了評價FSFC在更復(fù)雜環(huán)境下的可行性，用FSFC在含檸檬酸鐵的滅菌底泥中共培養(yǎng)GY32和S12。圖5C顯示在沒有共培養(yǎng)的沉積物中，只有少數(shù)顆粒顯示熒光，這可能是由于這些沉積物顆粒上固有的Fe 2+引起的，而沒有細菌樣顆粒顯示出熒光。 結(jié)果表明，F(xiàn)SFC在沉積物中的背景熒光很小，沉積物中非活性微生物不能觸發(fā)FSFC的熒光。 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，如圖5D顯示，S12表現(xiàn)出顯著的熒光，而絲狀細菌GY32沒有熒光，表明FSFC在含沉積物的環(huán)境中可視化FeRM的可行性。

Fig.5 S12和GY32共培養(yǎng)的熒光圖像

5.可視化并從混合物中分離單細胞FeRM

除了可視化FeRM外，從多物種樣品中分離FeRM對于了解鐵相關(guān)的生物地球化學(xué)過程是一個普遍而重要的需要。作者結(jié)合FSFC和PI來標(biāo)記富鐵還原反應(yīng)中的生物膜。CLSM顯示，活躍的FeRM細胞主要位于生物膜的外層，而內(nèi)層生物膜細胞活性較低，F(xiàn)SFC熒光較少，如圖6A. 7個有熒光的單細胞和6個沒有熒光的單細胞通過單細胞分選儀從沉積物富集的菌群中分離出來(圖6)。其中有3個分離的熒光單細胞被成功培養(yǎng)，它們都可以使用醋酸鹽作為電子供體來還原檸檬酸鐵(圖6G)，進一步證實了FSFC在FeRM分選中的可靠性。

Fig.6 基于FSFC可視化單細胞分選鐵還原菌。

四、結(jié)論

這項研究報告了一種方法，該方法可以將FeRM可視化并從含有多物種甚至沉積物的細菌培養(yǎng)物中分離出來。FSFC對Fe2+具有很高的靈敏度，選擇性和穩(wěn)定性，并且在液體和沉積物環(huán)境中均具有低背景熒光。 在含有FeRM的純培養(yǎng)物或共培養(yǎng)物中，F(xiàn)SFC可以選擇性地觀察活性FeRM。通過與單細胞分選技術(shù)相集成，可以從單細胞水平的樣品中有效地獲得目標(biāo)FeRM。 這種新穎的方法可能是獲得新的FeRM以及深入了解FeRM在不同環(huán)境中的生物地球化學(xué)作用的有力工具。

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