寫在首個數(shù)字PCR平臺獲批美國FDA之際。

本文作者為伯樂生命醫(yī)學大中華區(qū)LSG產品經理趙云。

趙云 伯樂生命醫(yī)學大中華區(qū)LSG產品經理

2019年2月14日，Bio-Rad 公司的QXDx AutoDG ddPCR系統(tǒng)及QXDx BCR-ABL%IS 試劑盒成為業(yè)內第一個獲得美國食品和藥物管理局(FDA)批準的數(shù)字PCR產品，510 (K) Number: K181661。這也使得Bio-Rad的微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術平臺成為業(yè)內目前唯一同時獲得歐洲CE-IVD和美國FDA許可的數(shù)字PCR設備；如果繼續(xù)獲得中國NMPA的三類醫(yī)療器械注冊，那么Bio-Rad的ddPCR技術設備將可以率先叩開全球主要國家和地區(qū)IVD市場的大門。據(jù)悉Bio-Rad QX200 ddPCR平臺在中國的IVD注冊工作也已處于臨床試驗階段。

Bio-Rad QXDx AutoDG ddPCR系統(tǒng)

數(shù)字PCR是核酸定量檢測方法的巨大飛躍

數(shù)字PCR沿襲了qPCR熒光化學原理，但數(shù)字PCR對靶標核酸的定量卻采用了完全不用的數(shù)學原理和方技術方法。其核心思想是使樣本中的核酸分子在若干獨立微反應單元中隨機分裝和擴增，在PCR反應的終點進行各反應單元的熒光信號檢測，沒有qPCR那樣的實時熒光信號讀取的過程。方法學的本質差異使得數(shù)字PCR具有更高靈敏度、重復和可靠性，而且摒棄了對外部參照和標準參考物質的依賴。

毫無疑問，數(shù)字PCR是核酸定量檢測方法上的巨大飛躍。但曾幾何時，理念的過于超前、操作太過繁雜、使用成本高，讓數(shù)字 PCR 在發(fā)展的道路上一度躑躅不前。直至新技術新思路的提出，特別是乳液PCR和微流控技術的融入，才使得數(shù)字 PCR 完成了從概念到成熟技術平臺的轉化，并成功實現(xiàn)商業(yè)化。而這其中，Bio-Rad 微滴式數(shù)字PCR無疑是行業(yè)翹楚。

腫瘤液體活檢是精準醫(yī)療發(fā)展的必然選擇

可以這樣說，ddPCR的臨床應用價值也是伴隨腫瘤精準醫(yī)療理念的提出以及在醫(yī)學實踐中推行的過程中逐漸被認知的。

當前的醫(yī)學實踐中，對大多數(shù)實體腫瘤遺傳狀態(tài)的分析是建立在侵入性手段獲取的腫瘤組織樣本上。由于取樣方式的傷害性，或者晚期癌癥病人的狀態(tài)不佳，又或某些癌癥的特殊性，使得組織樣本并不總是可以獲得的樣本，連續(xù)獲取組織樣本更加不切實際。

然而精準醫(yī)療方案的制定和調整必須了解腫瘤遺傳狀態(tài)的動態(tài)變化，又需要對病人重復取樣。因此腫瘤的液體活檢應運而生，成為臨床中精準醫(yī)療發(fā)展的必然選擇，并且成為行業(yè)的一次重要技術和理念的升級。而ddPCR的推出，應該說恰逢其時。

這是因為液體活檢本質上是為了解決兩個問題：樣本來源和檢測手段的問題。液體活檢采用非侵入式方法獲得血液及其他體液樣本，可供檢測的腫瘤來源的分子標志物包括ctDNA、cfRNA、非編碼RNA、外泌體等，尤其是以ctDNA為樣本對腫瘤相關的CNV/SNV、indel、表觀遺傳標志物進行分析，在當前的臨床實踐中得到推行。

然而ctDNA豐度低，且樣本中還存在高豐度的野生型背景干擾，要穩(wěn)定可靠地檢出微小序列變異，談何容易? 因此，穩(wěn)定可靠地施行基于ctDNA的液體活檢，對檢測手段的靈敏度和準確性提出了更高的要求。

定性到定量——腫瘤檢測的發(fā)展路徑

盡管qPCR已在IVD領域得到了非常廣泛應用，然而在液體活檢方面，基于qPCR的COBAS、ARMS以及Super-ARMS的檢測靈敏度卻要低于ddPCR。有國內外的系統(tǒng)研究表明，對于血漿中的EGFR T790M突變的檢測，ddPCR相比qPCR方法有更高的靈敏度[1,2,3],有助于篩選出更多可能受益的病人。理論上，ddPCR可以穩(wěn)定實現(xiàn)0.1%-0.001%的檢測靈敏度，這很大程度上有賴于可用于檢測分析的臨床樣本的量。舉例來說，如果能獲得100ng cfDNA，理論上ddPCR可穩(wěn)定達到0.01%的檢測靈敏度。

ddPCR的另一個優(yōu)勢就是對腫瘤標志物的絕對定量以及更好的數(shù)據(jù)重復性和再現(xiàn)性。這對于監(jiān)測標志物的動態(tài)變化，為療效的評估以及疾病進展的預測提供量化的數(shù)據(jù)意義重大。此外，對于提示耐藥的標志物的定量檢測(豐度百分比)，也有助于進一步篩選出含有低豐度耐藥突變，仍可受益于治療的病人，而不是簡單的以陽性或陰性進行判斷。

相信腫瘤標志物的檢測會有一個從靜態(tài)到動態(tài)，從定性到定量的發(fā)展過程。

總的來說，基于ddPCR的液體活檢，可克服腫瘤組織異質性對腫瘤進行分子分型，還可對疾病進展進行預測，實現(xiàn)療效實時監(jiān)測和評估，還包括對微小殘留病檢測。ddPCR對于已知用藥意義的腫瘤分子標志物的準確定量檢測，為腫瘤的精準醫(yī)療提供信息和依據(jù)，參與腫瘤病人的全程管理。

ddPCR技術趨于成熟，臨床應用已完成起步

在筆者看來，qPCR已經是非常成熟的技術，而ddPCR正處于快速增長的起步階段。從技術的視角上看，ddPCR在液體活檢的應用已經基本完成了起步，現(xiàn)在已經進入到接受市場和臨床實踐的冷靜思考和評判期，而這應該被看作是ddPCR技術趨于成熟的表現(xiàn)，或者說是ddPCR走向成熟的必經階段。

產品生命周期

ddPCR未來需要開展的工作，一方面是基于ddPCR的液體活檢流程的統(tǒng)一化、規(guī)范化和標準化，以及在臨床應用準入資格的獲得；另一方面，在科學嚴謹?shù)呐R床研究基礎上，確認基于ddPCR的檢測方法在不同IVD細分領域下的的臨床有效性、實用性；同時更多的臨床診斷試劑盒的廠家的積極介入，更快的推動ddPCR應用的深度和廣度上的發(fā)展。

事實上自商業(yè)化以來，數(shù)字PCR技術特別微滴式數(shù)字PCR技術獲得了快速發(fā)展。按照Markets and Markets的分析預測，全球qPCR和dPCR市場的年復合增長率有望將達到8.9%，到2022年達到5.31億美元的市場容量，并且預計dPCR的增長將超過qPCR。盡管數(shù)字PCR的市場開發(fā)任重道遠，但FDA的批準，無疑是ddPCR技術加快進入臨床應用的重要起點，也是數(shù)字PCR行業(yè)快速發(fā)展的重要切入點。

參考資料

1. Wenxian Wang, Zhengbo Song, and Yiping Zhang. A Comparison of ddPCR and ARMS for detecting EGFR T790M status in ctDNA from advanced NSCLC patients with acquired EGFR‐TKI resistance. Cancer Med. 2017 Jan; 6(1): 154–162.

2. Buder, A., Setinek, U., Hochmair, M.J. et al. Targ Oncol (2019). 3. 曹紫陽，吳偉，侯立坤，張偉，高彩霞，武春燕，張莉萍。微滴數(shù)字PCR與Super-ARMS PCR檢測非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑治療耐藥后血漿游離DNA EGFR 基因T790M突變的對比分析。中華病理學雜志 2018年12月第47卷第12期。

4. 注：

ddPCR平臺目前在中國大陸僅限于科研使用，不作為臨床診斷。

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