重組質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化及篩選

概述

質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的 DNA的片段(＜10kb)且結(jié)構(gòu)簡

單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限

制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒

轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源 DNA 的重組質(zhì)粒和無插入而自

身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源 DNA的片段和載體 DNA 的濃度

比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,

如載體去磷酸化等來zui大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如 互補(bǔ)現(xiàn)象

等來鑒別重組子和非重組子。

外源 DNA的片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：

1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互

補(bǔ)的粘性末端,這也是zui容易克隆的 DNA的片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同

限制酶的識別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源 DNA的片段末端匹配的限制

酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在 PCR 擴(kuò)增時，在 DNA的片

段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體

也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)

粒載體 DNA 均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可

能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種 DNA 的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)

到zui高shui平。還可將載體 DNA 的 5 磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, zui大限度地抑制質(zhì)粒DNA 的自身環(huán)化。帶 5 端磷酸的外源 DNA的片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生

一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入 E. coli 受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動修復(fù)。

3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由 DNA 聚合酶補(bǔ)

平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA 連接酶的

濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)

以促進(jìn) DNA 分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。

特殊情況下，外源 DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體

末端或外源 DNA的片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有

控制的使用 E. coli DNA 聚合酶Ⅰ的 klenow 大片段部分填平 3 凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)

變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。

本實(shí)驗所使用的載體質(zhì)粒 DNA 為 pBS,轉(zhuǎn)化受體菌為 E. coli DH5 菌株。由于 pBS 上

帶有 Ampr 和 lacZ 基因,故重組子的篩選采用 Amp 抗性篩選與 -互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的

方法。

因 pBS 帶有 Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有 pBS DNA

的轉(zhuǎn)化子才能在含有 Amp 的 LB 平板上存活下來;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則

不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS 上帶有 -半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和 -半乳糖苷酶 N 端 146 個氨基酸的

編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(diǎn),但并沒有破壞 lacZ 的閱讀框架,不影響其正

常功能。E. coli DH5 菌株帶有 -半乳糖苷酶 C 端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情

況下,pBS 和 DH5 編碼的 -半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在 pBS 和 DH5 融為一

體時可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種 lacZ 基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完

整的近操縱基因區(qū)段的 -半乳糖苷酸陰性突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫 -互補(bǔ)。由 -互補(bǔ)產(chǎn)生的 Lac+ 細(xì)菌較易識別，它在生色底物 X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷)下存在

下被 IPTG(異丙基硫代- -D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到 pBS 質(zhì)粒的

多克隆位點(diǎn)上后會導(dǎo)致讀碼框架改變, 表達(dá)蛋白失活, 產(chǎn)生的氨基酸片段失去 -互補(bǔ)能力,

因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培

養(yǎng)基上， -互補(bǔ)產(chǎn)生的 Lac+細(xì)菌由于含 -半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)

生乳酸，使 pH 下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去 -互補(bǔ)能力，因而

不產(chǎn)生 -半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質(zhì)粒與自身

環(huán)化的載體 DNA 分開。此為 -互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。

材料、設(shè)備及試劑

一、 材料

外源 DNA的片段: 自行制備的帶限制性末端的 DNA 溶液,濃度已知; 載體 DNA: pBS 質(zhì)

粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5 ,或 JM 系列等具有 -互補(bǔ)能

力的菌株。

二、 設(shè)備

恒溫?fù)u床，臺式高速離心機(jī)，恒溫shui浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養(yǎng)箱，

電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf 管。

三、 試劑

1、連接反應(yīng)緩沖液(10 )：0.5mol/L Tris Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L

二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500 g/ml 牛血清清蛋白(組分 V.Sigma 產(chǎn)品）（可用可不

用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。

2、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。 3、X-gal 儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的儲液, 包以

鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。

4、IPTG 儲液(200mg/ml): 在 800 l 蒸餾shui中溶解 200mg IPTG 后,用蒸餾shui定容至

1ml,用 0.22 m 濾膜過濾除菌，分裝于 eppendorf 管并儲于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養(yǎng)基(Maconkey Agar)：取 52g 麥康凱瓊脂加蒸餾shui 1000ml，微

火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至 60℃左右加入 Amp 儲存液使終濃度為 50mg/ml，

然后搖勻后涂板。

6、含 X-gal 和 IPTG 的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含 50 g/ml Amp 的 LB 平板表

面加 40ml X-gal 儲液和 4 lIPTG 儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于 37℃下放置 3-4 小時,

使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。

7、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑

8、煮沸法快速分離質(zhì)粒試劑

9、質(zhì)粒酶及電泳試劑

操作步驟

一、 連接反應(yīng)

1、取新的經(jīng)滅菌處理的 0.5ml eppendorf 管, 編號。

2、將 0.1 g 載體 DNA 轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源 DNA的片段。

3、加蒸餾shui至體積為 8 l,于 45℃保溫 5 分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷

卻至 0℃。

4、加入 10 T4 DNA ligase buffer 1 l, T4 DNA ligase 0.5 l, 混勻后用微量離心機(jī)

將液體全部甩到管底,于 16℃保溫 8-24 小時。 同時做二組對照反應(yīng)，其中對照組一只有質(zhì)粒載體無外源 DNA；對照組二只有外源

DNA的片段沒有質(zhì)粒載體。

二、 E. coli DH5 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

每組連接反應(yīng)混和物各取 2 l 轉(zhuǎn)化 E. coli DH5 感受態(tài)細(xì)胞。具體方法見第三章。

三、 重組質(zhì)粒的篩選

1、每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取 100 l 用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)

半小時以上,直至液體被完全吸收。

2、倒置平板于 37℃繼續(xù)培養(yǎng) 12-16 小時,待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出

平板。

3、放于 4℃數(shù)小時,使顯色完全（此步麥康凱培養(yǎng)基不做）。

不帶有 pBS 質(zhì)粒 DNA 的細(xì)胞,由于無 Amp 抗性,不能在含有 Amp 的篩選培養(yǎng)基上成

活。帶有 pBS 載體的轉(zhuǎn)化子由于具有 -半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色

菌落。在 X-gal 和 ITPG 培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了 -半乳糖苷

酶活性,在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和 x-gal 和 ITPG 培養(yǎng)基上均為白色菌落。

四、 酶切鑒定重組質(zhì)粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含 Amp 50 g/ml 的 5ml LB 液體培養(yǎng)基中,37℃下

振蕩培養(yǎng) 12 小時。使用煮沸法快速分離質(zhì)粒 DNA 直接電泳，同時以煮沸法抽提的 pBS 質(zhì)

粒做對照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時遷移率較 pBS 慢。再用與連接未端相對應(yīng)的限制

性內(nèi)切酶進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。

[注意]

1、DNA 連接酶用量與 DNA的片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使

用連接粘性末端酶量的 10-100 倍。 2、在連接帶有粘性末端的 DNA的片段時，DNA 濃度一般為 2-10mg/ml，在連接平齊

末端時，需加入 DNA 濃度至 100-200mg/ml。

3、連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在 0℃儲存數(shù)天，-80℃儲存 2 個月，但是在-20℃冰凍保存將

會降低轉(zhuǎn)化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管 T4 DNA 連接酶的zui適反應(yīng)溫度

為 37℃，在連接粘性末端時，反應(yīng)溫度以 10-16℃為好，平齊末端則以 15-20℃為好。

5、在連接反應(yīng)中，如不對載體分子進(jìn)行去 5 磷酸基處理，便用過量的外源 DNA的片段

（2-5 倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源 DNA 和載體連接的機(jī)會。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時，攜有載體 DNA 的轉(zhuǎn)化子為

淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩

選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，

影響挑選。

7、X-gal 是 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖

（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)shui解

后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG 是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，

為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo) lacZ 的表達(dá)。

8、在含有 X-gal 和 IPTG 的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體 DNA 的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而

攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在 37℃培養(yǎng)后放于冰箱 3-4 小時可使

顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。

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