相差顯微鏡

活細(xì)胞對(duì)光線是透明的，光線通過活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光鏡無法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。20世紀(jì)30年代 荷蘭 Zernike
原理：利用光的衍射和干涉特性，把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比，從而使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得清晰。

相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的步驟如下（1）調(diào)整好相差顯微鏡（2）觀察瓶皿準(zhǔn)備（3）調(diào)光；（4）調(diào)節(jié)與攝影（5）觀查細(xì)胞

細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。

若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。

各種細(xì)胞及各代細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡相同。
原代細(xì)胞、成體組織的潛伏期較長(zhǎng)，24h后僅見到部分細(xì)胞開始貼壁，9～12d長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞融合呈交叉重疊生長(zhǎng)。
傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體細(xì)胞潛伏期短，一般經(jīng)過懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞大量繁殖，逐漸相連成片而長(zhǎng)滿瓶底。

一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80％就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)甚至脫落。
懸浮細(xì)胞當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時(shí)也應(yīng)及時(shí)傳代。

注意事項(xiàng)
標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶或皿一般成像效果都較好，但反復(fù)刷洗過的玻璃或塑料器皿將嚴(yán)重影響分辨力。
準(zhǔn)備觀察的瓶、皿要平坦，質(zhì)地均勻，透光度好，在觀察前將培養(yǎng)瓶、皿面擦凈。
天氣較冷時(shí)，由于溫差使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，可輕輕將瓶?jī)A斜使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁，以得到好的相差像。
對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相差顯微照相，應(yīng)在換液后進(jìn)行，這樣可以去除漂浮的組織塊和死細(xì)胞，提高成像清晰度。
觀察細(xì)胞時(shí)要有無菌概念，動(dòng)作要輕，避免猛烈震蕩；觀察時(shí)間不要太長(zhǎng)，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

活細(xì)胞的觀察檢測(cè)方法

1、暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞

原理：利用特殊聚光器使光線不能進(jìn)入物鏡，經(jīng)過標(biāo)本的散射光線使物鏡被放大，因此在黑暗背景中可呈現(xiàn)明亮的像。

優(yōu)點(diǎn)：反差增大，分辨率提高，可觀察到5nm的微小質(zhì)點(diǎn)。

  應(yīng)用：觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、細(xì)菌和霉菌等。

2.縮時(shí)顯微攝影術(shù)觀察

優(yōu)點(diǎn)：可直接記錄活細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過程，能非常直觀地展現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的動(dòng)態(tài)變化，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜變化、細(xì)胞死亡等過程。
缺點(diǎn)：較昂貴

3.體外活細(xì)胞染色觀察

體外活細(xì)胞染色就是在體外培養(yǎng)條件下，用某種染料對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞生命活動(dòng)的一種方法。利用這種方法，可以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

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