硬組織的病理觀測對于研究骨骼、牙齒等器官疾病的發(fā)展具有很重要的意義。但是硬組織由于其本身硬度大難以被傳統(tǒng)的薄片切割機直接切割，因此在切割之前往往需要脫鈣處理，使其軟化以達(dá)到刀片所能夠承受的硬度范圍內(nèi)進行切割。但是鈣質(zhì)作為骨骼和牙齒的組成部分，進行脫鈣將不可避免的丟失所研究器官中的信息，尤其是在含鈣量高的牙釉質(zhì)等部位中。同時，鈣在早期硬組織愈合如牙質(zhì)修復(fù)、骨創(chuàng)傷愈合等過程中也起著重要作用。另外脫鈣還不可避免的改變了硬組織的形貌，諸如厚度變化、褶皺、軟硬組織分離等問題。因此尋找無需脫鈣的切割方法對于研究硬組織研究是十分必要的。

隨著激光技術(shù)的發(fā)展，這一難題有望得到解決。對于刀片切割來說，受到刀片材料本身的限制，無法切割比刀片更硬的物體，但是這個困難在激光切割中并不存在 。然而激光切割也有其缺點：首先作為一種高能光束，其本身蘊含的能量較高容易灼傷物體表面，從而影響切割效果；另外受到激光在穿透物體時將不可避免的被所穿透物體中的組分散射，從而限制了激光切割的深度。近幾年發(fā)展較為迅速的雙光子聚焦技術(shù)給激光3D切割帶來了新的可能。

雙光子切割具有如下優(yōu)勢：首先雙光子能夠穿透一定深度的樣品，因此能夠直接在物體內(nèi)部進行切割，進而實現(xiàn)對組織深層區(qū)域的切割；其次雙光子的聚焦點能夠精準(zhǔn)控制，可實現(xiàn)以往切割設(shè)備不能實現(xiàn)的3D切割；另外雙光子一般采用近紅外激光作為激發(fā)光源，這類激光往往擁有最佳穿深并且對于蛋白的吸收較低，基本不會灼傷樣品。最后雙光子切割相比于傳統(tǒng)打磨方法來說更為精準(zhǔn)，樣品的損失更少。

在制樣上來說，雙光子切割也十分的簡單。根據(jù)目前文獻(xiàn)上主要采用的方法可以總結(jié)為：首先使用甲醛固定，然后使用PMMA包埋，接下來使用雙光子激光切割設(shè)備切割，經(jīng)過簡單打磨后，就可以染色壓片了。這比起傳統(tǒng)的硬組織切割步驟更為簡單，制備時間更短。并且制備效果比傳統(tǒng)方法更優(yōu)。 

激光切割人體第四腰椎垂直切片前部。C. SEM; D. PLM; E. SEM + PLM。從圖中可以清晰看到骨組織表面修復(fù)。 

觀察基因缺陷對骨組織的影響 

小鼠脛骨的SEM圖像。A.Phospho1敲除（KO）的脛骨近端顯示非礦化基質(zhì)類骨；B. 脛骨骨干。白色箭頭顯示骨髓內(nèi)表面的骨樣斑塊。黑色箭頭顯示位于皮質(zhì)血管的骨樣區(qū)（向下至20-50 lm區(qū)域）的大小變化；C. 膝蓋。致密纖維結(jié)締組織骨膜位于白色箭頭處；D.WT的對照關(guān)節(jié)。 

觀察手術(shù)后的骨組織再生 

節(jié)段性缺損愈合的組織形態(tài)學(xué)評價。a-d。Safranin Orange/von Kossa染色觀測修復(fù)手術(shù)愈合效果的脛骨代表性圖片，LA，外側(cè)；ME，內(nèi)側(cè)；PR，近端；DI，遠(yuǎn)端，對側(cè)鋼板。e.手術(shù)后第一周內(nèi)采集的對照樣本作標(biāo)本圖片。自體松質(zhì)骨移植（ABG）對蜂巢的增強作用黑色（藍(lán)色星）和支架中心孔內(nèi)明顯的截骨術(shù)血腫（白色星）仍然可見。 

牙齒病理觀測 

 大鼠牙本質(zhì)切片觀測

 人牙齒切片觀測

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