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文檔簡(jiǎn)介 細(xì)菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）主要用途細(xì)菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色譜法（HPLC）定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)高氯酸酸性處理，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長(zhǎng)）檢測(cè)分析，分離出ATP、ADP或AMP波峰，以定量測(cè)定樣品中腺嘌呤核苷酸含量的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌樣品中ATP、ADP、AMP的含量檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景腺嘌呤核苷酸（adeninenucleotides），簡(jiǎn)稱(chēng)腺苷，包括單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一種單體單位，為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的組成成分，并提供化學(xué)能量，在能量代謝通路中維護(hù)諸如肌肉、胞膜等組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生化和生理功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞系統(tǒng)、氧化磷酸化活動(dòng)。腺嘌呤核苷酸在細(xì)胞中濃度低，且不穩(wěn)定，通常通過(guò)其類(lèi)型不同、濃度差異、分布狀況，來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的代謝情況和能量狀態(tài)。單磷酸腺苷（Adenosinemonophosphate；AMP），又稱(chēng)為5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5'-adenylicacid），是一種在（脫氧）核糖核酸中發(fā)現(xiàn)的核苷酸。它是一種磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基團(tuán)、戊糖核酸糖及堿基腺嘌呤所組成。分子式為C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通過(guò)腺苷酸激酶（adenylatekinase）催化2分子ADP生成，或通過(guò)ATP以及ADP水解產(chǎn)生。AMP常以腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸（cAMP）形式存在于細(xì)胞中。AMP與ATP之比反映細(xì)胞ATP生成狀況以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosinediphosphate；ADP），參與ADP-ATP循環(huán)，提供熱能轉(zhuǎn)換和動(dòng)態(tài)平衡。三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。通過(guò)高氯酸酸性處理，排除蛋白質(zhì)干擾，堿性中和后，在高效液相色譜儀和紫外光度儀下（254nm波長(zhǎng)）檢測(cè)分析，分離出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。產(chǎn)品內(nèi)容酸性液（ReagentA）毫升中和液（ReagentB）毫升流相液A（ReagentC）毫升流相液B（ReagentD）毫升標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）微升產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1份保存方式保存標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（ReagentA）和中和液（ReagentB）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月用戶(hù)自備1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作高效液相色譜儀（HPLC）：用于定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟樣品準(zhǔn)備準(zhǔn)備好待測(cè)細(xì)菌樣品進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)：在分光光度儀上測(cè)定OD600或直接計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如eppendorf5415）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒加入XX微升預(yù)冷的酸性液（ReagentA）渦旋震蕩1分鐘轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)再次離心10分鐘，速度為6000g小心移取上清液到新的1.5毫升離心管加入XX微升中和液（ReagentB），充分混勻置于冰槽里靜置30分鐘即刻移入上清液到新的1.5毫升離心管（注意：避免移取沉淀顆粒）放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里待測(cè)二、測(cè)定準(zhǔn)備開(kāi)啟儀器預(yù)熱15分鐘根據(jù)下表設(shè)置高效液相色譜儀（HPLC）參數(shù)參數(shù)推薦補(bǔ)充說(shuō)明色譜柱長(zhǎng)度：25cm直徑：4.6mmWaters儀器或Agilent儀器固定相ODS流動(dòng)相流相液A（ReagentC）和流相液B（ReagentD）參見(jiàn)運(yùn)行程序流速1.3毫升/分鐘注射容量50微升10微升至100微升檢測(cè)紫外波長(zhǎng)254nm柱溫25℃出峰時(shí)間（retention）5.6分鐘（ATP）；6.5分鐘（ADP）；10分鐘(AMP)參考運(yùn)行時(shí)間15分鐘參考運(yùn)行程序運(yùn)行時(shí)段程序時(shí)間開(kāi)機(jī)后預(yù)運(yùn)行XX流相液A（ReagentC）總10分鐘檢測(cè)運(yùn)行時(shí)段XX流相液A（ReagentC）XX流相液B（ReagentD）0至9分鐘XX流相液A（ReagentC）至XX流相液A（ReagentC）XX流相液B（ReagentD）至XX流相液B（ReagentD）9至15分鐘關(guān)機(jī)前運(yùn)行XX流相液A（ReagentC）XX流相液B（ReagentD）總10分鐘標(biāo)準(zhǔn)樣品配制準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管分別加入XX微升流相液A（ReagentC）到1至5號(hào)管移取XX微升標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）到1號(hào)管，混勻小心移取XX微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）到2號(hào)管，混勻小心移取XX微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）到3號(hào)管，混勻小心移取XX微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）到4號(hào)管，混勻?qū)?至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表管號(hào)流相液A（ReagentC）標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）標(biāo)準(zhǔn)ATP/ADP/AMP濃度1XX微升XX微升XX微摩爾/升2XX微升XX微升1號(hào)管XX微摩爾/升3XX微升XX微升2號(hào)管XX微摩爾/升4XX微升XX微升3號(hào)管XX微摩爾/升5XX微升00四、色譜分析將上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）和待測(cè)樣品放進(jìn)冰槽里等待每次（每個(gè)樣品）注射50微升按照檢測(cè)運(yùn)行程序每次（每個(gè)樣品）運(yùn)行15分鐘獲得色譜波峰圖：波峰面積（peakarea）或峰值，保存記錄注意事項(xiàng)本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液操作時(shí)，須戴手套系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次試劑具有揮發(fā)性，注意密閉瓶蓋或使用封口膜酸性液（ReagentA）和中和液（ReagentB）具有腐蝕性，注意操作安全建議使用流相液A（ReagentC）作為陰性對(duì)照或作為基準(zhǔn)線色譜柱的異物殘留、氣泡產(chǎn)生、溫度未達(dá)均衡等將導(dǎo)致異常波峰、時(shí)間偏移等用戶(hù)可以使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)加入到樣品中，然后進(jìn)行萃取，檢測(cè)回收率（recovery）腺嘌呤核苷酸的出峰時(shí)間（retention）以用戶(hù)操作時(shí)，使用的標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentE）實(shí)際出峰為準(zhǔn)用戶(hù)可以根據(jù)要求，計(jì)算實(shí)際濃度為：納摩爾/毫升、納摩爾/毫克蛋白等如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度腺嘌呤核苷酸HPLC的參考圖譜如下：
標(biāo)簽： 相關(guān)產(chǎn)品